定量脂质组学揭示生理性衰老过程中血浆凋亡性细胞外囊泡（ApoEVs）的脂质重塑与衰老相关循环标志物

《Frontiers in Cell and Developmental Biology》：Quantitative lipidomics reveals Lipid perturbation of plasma apoptotic extracellular vesicles during physiological aging

　　

引言：衰老与慢性疾病、退行性病变及死亡率的发生机制密切相关，是老年科学（geroscience）的核心研究焦点。作为凋亡细胞的直接分泌产物，凋亡小体（apoptotic bodies）能直接反映凋亡活动强度以及全身和细胞衰老程度。鉴于其与衰老进程密切相关，凋亡小体作为评估衰老状态的可靠且敏感的生物标志物具有巨大潜力。然而，凋亡小体作为衰老的有效指标仍有待探索。方法：研究人员表征了凋亡小体（ApoEVs）的脂质谱，并探索了与衰老相关的脂质种类变化。对血浆凋亡小体内总脂质、多种脂质亚类及脂肪酸饱和度进行分析，以鉴定衰老相关脂质改变。结果与讨论：血浆凋亡小体内总脂质、多种脂质亚类和脂肪酸饱和度的全面降低，突出了衰老中的全身性脂质重编程。Hex₂Cer（二己糖神经酰胺）、LPC（溶血磷脂酰胆碱）、LPE（溶血磷脂酰乙醇胺）、TG（甘油三酯）、ChE（胆固醇酯）、SM（鞘磷脂）和SPH（鞘氨醇）总水平下降是衰老的特征。该研究不仅加深了对衰老相关脂质功能障碍的理解，还为评估生物学衰老和年龄相关病理提供了循环脂质生物标志物。

随着年龄增长，慢性疾病、退行性病变和死亡率风险上升，衰老成为老年科学（geroscience）的核心研究焦点。血浆因异时共生实验中可通过生物货物交换使老年组织年轻化而受到重视，血浆生物标志物具有微创、易获取、时间和成本效率高等优势。凋亡性细胞外囊泡（apoptotic extracellular vesicles, ApoEVs）由凋亡细胞通过膜起泡或突起形成，携带反映亲代细胞生理状态的分子特征，并参与多种生物过程调控。既往研究表明，ApoEVs与细胞衰老存在功能联系，凋亡缺陷和ApoEVs分泌减少可导致DNA损伤积累和早衰，其组成重塑可反映系统性衰老进程。然而，聚焦与衰老密切相关的血浆ApoEVs研究仍 scarce且未见报道。脂质是细胞稳态的重要结构和功能分子，脂质组学（lipidomics）已用于液体活检和生物流体来源细胞外囊泡的诊断性脂质生物标志物识别，但年轻和年老个体血浆ApoEVs脂质谱差异尚未表征，哪些特定脂质影响健康长寿和年龄相关疾病进展尚不清楚。因此，研究人员提出衰老会触发血浆ApoEVs中的系统性脂质重编程，并拟通过比较年轻和年老个体血浆ApoEVs脂质谱来揭示这些变化。研究纳入健康年轻和年老个体，开展绝对定量脂质组学分析，发现衰老过程中血浆ApoEVs总脂质、多个脂质亚类和脂肪酸饱和度全面下降，Hex₂Cer、LPC、LPE、TG、ChE、SM和SPH总水平降低构成衰老特征。该研究加深了对衰老相关脂质功能障碍和凋亡清除缺陷的理解，并提供评估生物学衰老和年龄相关病理过程的潜在循环脂质生物标志物。

关键技术方法概括：研究人员采用差异离心从血浆分离ApoEVs，并以纳米颗粒跟踪分析（nanoparticle tracking analysis, NTA）、透射电子显微镜（transmission electron microscopy, TEM）和蛋白免疫印迹（western blotting, WB）进行表征；以甲基叔丁基醚（methyl tert-butyl ether, MTBE）法提取脂质；采用反相液相色谱-串联质谱（liquid chromatography-tandem mass spectrometry, LC-MS/MS）在正负离子模式下绝对定量脂质，并用LipidSearch鉴定；随后进行主成分分析（principal component analysis, PCA）、偏最小二乘判别分析（partial least squares-discriminant analysis, PLS-DA）/正交偏最小二乘判别分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis, OPLS-DA）、置换检验及MetaboAnalyst通路分析。样本队列来源于四川大学华西公共卫生学院健康管理中心和四川大学华西第四医院常规健康筛查项目，共招募50名健康参与者，其中24名确认无重大系统性疾病并纳入；研究包括12名健康年老参与者（>65岁）和12名健康年轻参与者（20–30岁），每组6男6女；伦理批准号为HXSY-EC-2022039。

研究结果：
3.1 年轻和衰老血浆来源ApoEVs的表型与分子表征：通过NTA、TEM和WB对年轻与年老血浆来源ApoEVs进行表征。NTA显示二者均具有凋亡性细胞外囊泡典型的尺寸分布特征；TEM确认经典杯状超微结构；WB显示cleaved Caspase-3富集，支持其凋亡来源，而histone H3在总细胞裂解液中丰富，但在年轻和年老ApoEVs中几乎检测不到，提示ApoEVs内核组蛋白H3货物负载极少。
3.2 血浆ApoEVs脂质组成：通过绝对定量脂质组学分析，共鉴定并定量953种脂质，分为32个脂质类别。磷脂酰胆碱（phosphatidylcholine, PC）种类最多，为187种，其次为TG（182种）和磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamine, PE，123种）。基于绝对脂质定量，ChE、PC、SPH、蜡酯（wax esters, WE）、磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol, PI）和PE是血浆ApoEVs主要脂质部分，占总脂质70%以上。与年轻组相比，年老组总脂质数量下降；Hex₂Cer、LPC、LPE、TG、ChE、SM和SPH在年轻和年老组间存在显著差异。
3.3 ApoEVs脂质谱：通过PCA可视化组间分离，三个质量控制（quality control, QC）样本在PCA得分图中紧密聚类，提示脂质组学平台稳定可靠；年老组血浆样本与年轻组区分，表明年轻和年老血浆来源ApoEVs脂质谱模式不同。进一步OPLS-DA获得R²X=0.677、R²Y=0.992和Q²=0.847，显示较强解释力和较高预测能力，年老与年轻组在得分图中清楚分离；200次置换检验确认模型稳健。PCA和OPLS-DA共同表明年轻和年老组血浆ApoEVs脂质代谢谱存在明显差异。
3.4 脂质种类差异与通路分析：按变量投影重要性（variable importance in projection, VIP）>1且P<0.05筛选，共得到27种显著差异脂质。与年轻组相比，TG（15:0_16:0_18:2）水平在年老组升高，其余26种脂质显著降低；含18:1/18:2的TG、PC和ChE在年老ApoEVs中显著耗竭，提示年龄相关脂质丢失具有一定链长和不饱和度特异性。热图层次聚类显示年轻组和年老组样本在树状图中聚为两簇。使用MetaboAnalyst 6.0进行通路分析，甘油磷脂代谢、鞘脂代谢、亚油酸代谢和α-亚麻酸代谢为富集通路，其中甘油磷脂代谢影响值>0.10且P<0.05，气泡最大且颜色最深。
3.5 脂质链长与饱和度分析：碳链长度分析显示年轻和年老组间无显著差异，不同链长种类的相对丰度基本不变。靶向脂质组学显示，与年轻组相比，年老ApoEVs中多类脂质显著耗竭，包括含3、4、5和10个双键的TG，含5和6个双键的PC，含1和3个双键的SM，含2和3个双键的Cer，含1个双键的ChE，含1、5和6个双键的CL，含2个双键的Hex₁Cer，含3和4个双键的Hex₃Cer，含0、1、2和4个双键的LPC，含2、3、4和5个双键的LPE，含0个双键的WE，含6和7个双键的PS，含0个双键的SPH，以及含10个双键的PIP。多数耗竭种类携带低双键数（0至5），属于饱和、单不饱和或低不饱和脂质实体；这些饱和/单不饱和脂质种类的选择性减少导致年老ApoEV脂质组总体脂质饱和度显著下降，表明年老ApoEVs的囊泡膜和储存脂质区室在衰老过程中向相对更不饱和状态转变。

讨论部分总结：讨论指出，医学研究重心正从疾病预防和治疗转向促进健康和健康衰老。ApoEVs由凋亡细胞分泌，携带多种生物活性因子，在全身和组织稳态中发挥作用，并介导细胞间通讯和凋亡碎片清除，而该过程随年龄逐渐受损。脂质代谢改变与年龄相关，脂质组特征整合遗传、环境和生理线索，可作为生物衰老的可靠代理。研究人员分析年轻和年老个体血浆ApoEVs脂质组，发现总脂质及Hex₂Cer、LPC、LPE、TG、ChE、SM和SPH等关键脂质亚类下降，反映膜结构、凋亡信号和脂质代谢的深刻紊乱。鞘脂类包括SM、SPH和Hex₂Cer，在细胞衰老和衰老中具有重要作用；SPH水平降低可能损害S1P（sphingosine-1-phosphate，鞘氨醇-1-磷酸）介导的抗衰老信号。LPC和LPE下降提示衰老中溶血磷脂代谢失调，既往关于LPC与衰老的研究结果不一致，可能与性别差异有关。TG和ChE下降反映中性脂质代谢、脂质储存和能量稳态紊乱。研究还发现，主要脂质类别的碳链长度未改变，而总体脂肪酸饱和度显著下降，这一观察解耦了链长与饱和度两个基本脂质结构属性，突出衰老驱动的血浆ApoEVs脂质去饱和动力学选择性扰动。人血浆脂质组景观显示甘油磷脂代谢与代谢物相关性最强；本研究中甘油磷脂代谢是衰老中最深刻失调的通路。年老ApoEVs中含18:1和18:2的TG、PC和ChE物种耗竭，表明年龄相关血浆脂质组重塑超出简单数量丢失，并与Patel等关于衰老显著下调循环外泌体和衰老细胞来源细胞外囊泡中多个TG物种的脂质组学结果一致。机制上，含18:2的PC和ChE耗竭尤其值得注意，亚油酸（18:2）是花生四烯酸和下游氧化脂质（oxylipins）的必需前体，油酸（18:1）对维持膜流动性和通过硬脂酰-CoA去饱和酶1（stearoyl-CoA desaturase 1, SCD1）缓冲脂毒性至关重要；二者共同下降可能损害ApoEV膜生物物理性质，进而损害胞葬作用（efferocytosis），而衰老组织本已存在该过程缺陷。Yan等显示，年轻和年老脂肪干细胞来源ApoEVs均可诱导皮肤愈合和减少瘢痕形成，但年轻ApoEVs在促进成纤维细胞和内皮细胞增殖、迁移及新生血管能力方面显著高于年老ApoEVs；研究人员认为这种功能下降可能部分由本研究中观察到的脂质组成改变支撑，但将特定脂质种类与功能结果联系起来的直接因果证据尚待建立。年龄相关总脂质和脂肪酸饱和度下降可能反映线粒体功能障碍、自噬/脂噬受损、过氧化物酶体失败以及PPARs/PGC-1α失调驱动的多因素代谢重编程。尽管个体脂质变化可能具有代偿性，但年龄相关“脂质漂移”、胆固醇转运缺陷、脂筏病理和神经酰胺积累可主动驱动神经退行性变和其他衰老病理。早期适应性变化可逆，但一旦越过细胞器功能障碍和慢性炎症临界点，系统性脂质下降便成为衰老的适应不良驱动因素。本脂质组特征可能反映阈值后状态，使这些脂质既可作为衰老生物标志物，也可作为治疗靶点。

研究结论翻译：综合而言，血浆凋亡小体内总脂质、多种脂质亚类和脂肪酸饱和度的全面降低，突出了衰老中的系统性脂质重编程。Hex₂Cer、LPC、LPE、TG、ChE、SM和SPH总水平下降是衰老的特征。该特征不仅加深了对衰老相关脂质功能障碍和凋亡清除缺陷的理解，还为评估生物学衰老和年龄相关病理过程提供了潜在循环脂质生物标志物。