日粮大麻素受体2（CB2）激动剂β-石竹烯联合增加降温频率对环境热负荷下奶牛免疫、应激和发热反应的影响

《Frontiers in Immunology》：Immune-modulating effects of dietary cannabinoid-receptor 2 agonist beta-caryophyllene and cooling frequency in dairy cows under environmental heat load

　　

背景：环境热负荷会负面影响家畜的生产力、福利和免疫功能。内源性大麻素系统（endocannabinoid system，ECS）调节免疫功能，而大麻素受体2（cannabinoid receptor 2，CB₂）的激活多具有抗炎作用。研究人员假设，增加降温频率并提供日粮CB₂激动剂β-石竹烯（β-caryophyllene，BCP）可影响热应激奶牛的免疫功能。方法：40头处于环境热负荷条件下的中泌乳期荷斯坦奶牛，根据产奶量、体重、胎次和泌乳天数随机分配至4个处理：对照组（control，CTL）或补充BCP（5 mg/kg BW），且每个日粮处理中一半奶牛分别接受每天3次或6次降温 session（cooling sessions，CS），形成2 × 2析因设计（每组n = 10）：CTL-6CS、CTL-3CS、BCP-6CS和BCP-3CS。测定产奶量、采食量和行为参数。第5周，每组6头奶牛接受乳房内脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）攻击。采集阴道温度和血样以分析应激和免疫功能参数。分析BCP、CS、时间及其交互作用的主效应。结果：BCP补充较CTL增加血浆BCP浓度。LPS攻击前，BCP不影响生产性能和采食量，但BCP增加休息时段持续时间并减少采食时间。与3CS相比，6CS奶牛的瘤胃反刍时间更长，喘气时间和呼吸频率更低。LPS攻击期间，BCP奶牛在发热峰值时阴道温度较低，BCP-6CS奶牛温度最低。BCP-6CS奶牛血浆皮质醇曲线下面积（area under the curve，AUC）有低于CTL-3CS的趋势。与CTL相比，BCP奶牛LPS后血液单核细胞百分比较低；而BCP较CTL增加平均血小板体积、平均血小板质量和血小板质量分布宽度。结论：热负荷期间日粮BCP降低了对炎症攻击的发热峰值反应，并具有中等且特定的免疫调节和应激缓解作用，且与增加CS频率有一些叠加效应。因此，日粮补充CB₂激动剂可能是一种改善奶牛免疫功能、应激反应和福利的新型策略。

研究背景与问题：环境热负荷由高环境温度和高湿度共同构成，是影响家畜生产力的重要非生物因素。温度-湿度指数（temperature-humidity index，THI）常用于指示奶牛热负荷程度，70或以下较舒适，75–78为应激，超过78为极端 distress 且体温调节困难。气候变化预计将增加热负荷事件的强度和频率，高产奶牛尤其受影响。热负荷还会启动炎症反应和免疫级联，增加牛血细胞中促炎细胞因子表达，降低淋巴细胞增殖，并损害免疫细胞功能，增加乳房内感染易感性，表现为中性粒细胞吞噬能力降低、体细胞计数（somatic cell count，SCC）升高和夏季乳腺炎发生率增加。目前最常用的管理工具是降温 session（cooling session，CS），即喷水器和风扇联合使用，但即使技术前沿的管理适应策略也可能不足以抵偿气候变化对奶牛生产的影响。因此，需要改善热应激家畜免疫功能的新策略。研究人员假设激活ECS可改善奶牛免疫功能；CB₂在免疫细胞中高表达，其激活多触发抗炎反应，调节促炎细胞因子释放、免疫细胞迁移和增殖。植物大麻素β-石竹烯（β-caryophyllene，BCP）是CB₂选择性结合激动剂，前期体外研究提示其可影响奶牛外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMC）对LPS攻击的炎症反应。因此，本研究假设日粮补充BCP可通过白细胞中CB₂介导反应调节热应激奶牛免疫功能，并可能与增加CS频率产生协同增强作用，影响动物福利和应激反应。

研究人员开展的研究及结论与意义：本研究在峰值夏季开展5周试验，将40头中泌乳期荷斯坦奶牛按产奶量、体重、胎次和泌乳天数随机分配至2 × 2析因设计：CTL或BCP补充（5 mg/kg BW），以及每天3次或6次CS。第5周，每组6头奶牛接受乳房内LPS攻击。研究得出，BCP口服补充具有生物利用度，不影响生产性能；BCP具有中等且特定的免疫调节和应激缓解作用，并降低LPS攻击后的发热峰值反应，且增加CS频率带来一些额外效应。其意义在于，日粮补充CB₂激动剂可能成为环境热负荷下改善奶牛免疫功能、应激反应和福利的新型营养策略。

关键技术方法：研究队列来源于Volcani Institute dairy farm个体饲喂牛舍，在以色列峰值夏季进行5周试验，使用40头中泌乳期荷斯坦奶牛。采用2 × 2析因设计，设置日粮BCP补充与每天3次或6次CS。第5周进行乳房内LPS攻击。连续使用iButton温度记录器测定阴道温度，采集血样检测皮质醇、葡萄糖、结合珠蛋白、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、D2Dx免疫评分、细胞因子和趋化因子；进行全血细胞计数、流式细胞术分析白细胞亚群；使用混合模型和一般线性模型分析主效应及交互作用。

研究结果：

3.1 口服BCP的生物利用度及BCP和CS频率对生产与行为指标的影响。通过第4周血浆BCP检测，发现口服5 mg/kg BW BCP较CTL增加血浆BCP浓度（1.82 vs. 0.00 ppb，P < 0.0001）。LPS攻击前4周，BCP不影响干物质采食量（dry matter intake，DMI）、产奶量、乳成分、喘气时间和直肠温度；瘤胃反刍时间（P_BCP = 0.06）和呼吸频率（P_BCP = 0.10）仅呈趋势。BCP减少采食时间（149.7 vs. 186.9 min/d，P_BCP = 0.01），并延长休息时段持续时间（P_BCP = 0.005），且BCP×CS交互显著（P_BCP×CS < 0.0001）。与3CS相比，6CS奶牛乳糖浓度更高，瘤胃反刍时间更长，喘气时间和呼吸频率更低，休息时间更长，LogSCC更低。BCP×CS交互对休息时间、休息时段持续时间和产奶量显著；时间效应对DMI、瘤胃反刍、喘气、产奶和乳成分显著。

3.2 BCP和CS频率对LPS攻击期间阴道温度、应激和炎症血标志物的影响。通过连续阴道温度监测，LPS攻击后奶牛阴道温度迅速升高，4.5–7 h达到发热峰值，约10 h恢复近基础水平。BCP补充奶牛在发热峰值附近阴道温度较CTL低0.45°C，BCP-6CS最低；BCP组阴道温度AUC低于CTL（1981.1 vs. 1998.2 °C × min，P_BCP = 0.01）。6CS奶牛在发热峰值时阴道温度低于3CS。通过血浆分析，BCP、CS及其交互对平均皮质醇浓度主效应不显著，但BCP-6CS数值最低；5 h post-LPS时BCP-6CS较CTL-3CS有更低趋势（76.8 vs. 148.5 ng/ml，P = 0.06），14.5 h post-LPS时也有更低趋势（12.4 vs. 46.7 ng/ml，P = 0.07），14.5和24 h post-LPS时BCP-6CS低于CTL-3CS（8.2 vs. 35.7 ng/ml，P = 0.01）；皮质醇AUC在BCP-6CS较CTL-3CS有更低趋势（551.1 vs. 1333.3 ng/ml × h，P = 0.07）。葡萄糖、结合珠蛋白、MDA和D2Dx无差异。BCP奶牛14.5和24 h post-LPS时MIP-1β浓度低于CTL（22.6 vs. 31.3 pg/mL，P_BCP = 0.05），6CS较3CS在24 h post-LPS内MIP-1β较低（214.6 vs. 447.4 pg/mL，P_CS = 0.05）。其他细胞因子和趋化因子未受BCP显著影响；BCP×CS对IP-10显著。时间效应对皮质醇、结合珠蛋白、MDA、D2Dx、IL-6、IFNγ、IL-1α、IL-10、MIP-1α、MIP-1β、IP-10和MCP-1显著。

3.3 LPS、BCP和CS频率对LPS攻击期间血液和免疫细胞群体的影响。通过流式细胞术比较LPS前后，发现5 h post-LPS时血液CD4⁺百分比增加，CD14⁺、CD16⁺和CD14⁺CD16⁺群体降低。LPS前，BCP×CS交互对CD335⁺和CD335⁺WC1⁺细胞显著，对WC1⁺有趋势。LPS后，BCP×CS交互对CD16⁺、CD335⁺、WC1⁺和CD335⁺WC1⁺显著，对CD4⁺CD8⁺、CD14⁺、CD4⁺和CD14⁺CD16⁺有趋势，表明BCP与CS联合重塑先天免疫和γδ相关淋巴细胞对LPS攻击的反应。基线免疫细胞比例组间相似，未检测到BCP或CS对免疫细胞群体的显著主效应。通过全血细胞计数，5 h post-LPS时白细胞、中性粒细胞和淋巴细胞绝对计数及百分比在BCP或CS处理间无差异，单核细胞百分比在BCP较CTL有降低趋势（P_BCP = 0.06）；6CS较3CS增加嗜酸性粒细胞百分比，嗜碱性粒细胞计数受BCP×CS交互影响。7.5 h post-LPS时，BCP补充奶牛单核细胞百分比低于CTL（1.79 vs. 2.80%，P_BCP = 0.02），嗜碱性粒细胞百分比在BCP有更高趋势。红细胞和血小板分析中，5 h post-LPS时BCP×CS交互对红细胞计数、血红蛋白分布宽度、平均网织红细胞体积、网织红细胞细胞血红蛋白、平均血小板质量和血小板质量分布宽度显著；BCP增加平均血小板质量、平均血小板体积和血小板质量分布宽度。7.5 h post-LPS时，BCP奶牛平均血小板体积高于CTL。CS频率影响平均网织红细胞体积和血小板分布宽度；BCP×CS交互对7.5 h post-LPS红细胞计数、血红蛋白和红细胞压积显著。

讨论部分总结：研究人员认为，口服BCP 5 mg/kg BW具有生物利用度，与绵羊模型中BCP瘤胃降解较低一致，因此推测该剂量足以实现系统暴露并潜在诱导免疫细胞中CB₂介导反应。BCP不影响DMI、产奶量、乳成分和SCC，这与terpene补充或不影响生产性能的报道一致。BCP减少采食时间但不影响DMI，提示可能影响采食行为模式。BCP增加休息时段持续时间，且BCP-3CS奶牛休息时间长于CTL-3CS且与CTL-6CS无差异，提示BCP可能部分补偿较低降温频率。皮质醇AUC在BCP-6CS较CTL-3CS有更低趋势，研究人员提出这反映BCP/CB₂介导的应激反应轴调节。BCP奶牛LPS攻击后发热峰值较低，提示抗炎作用；研究人员提出CB₂介导反应可能通过减少循环免疫细胞细胞因子分泌和减弱PGE₂产生等中断发热级联。BCP奶牛MIP-1β在LPS后降低，提示CB₂刺激后单核细胞活化减弱。MDA未变化，研究人员认为主要作用经由CB₂介导反应，较高剂量BCP可能影响抗氧化通路。流式结果显示LPS后CD14⁺和CD16⁺群体降低，可能反映单核细胞向LPS攻击乳腺迁移；BCP×CS交互表明CB₂介导反应与降温强度共同重塑单核细胞、NK细胞和γδ T细胞反应。血小板指标升高可能提示BCP补充奶牛LPS后血小板活化和功能参与增强，并与单核细胞百分比和嗜碱性粒细胞计数变化相关，提示协调的血液学反应可能部分由CB₂相关反应介导。

研究结论翻译：在本研究中，研究人员发现以5 mg/kg BW补充BCP具有生物利用度，并且不影响泌乳奶牛的生产性能。补充BCP的奶牛具有某些中等程度的免疫调节和应激缓解特性，这可能反映CB₂介导的免疫和应激反应的独特调节。在休息行为和特定免疫参数中检测到显著的BCP × CS交互作用，表明BCP与频繁CS联合也可能影响对热负荷和炎症的反应。主要基于研究人员对乳房内LPS攻击后发热反应降低这一发现，研究人员提出，日粮BCP，更广泛地说CB₂激动剂，可能在热应激奶牛中具有中等抗炎特性，并可作为环境热负荷下的一种新型营养策略。进一步研究应探究这些作用的机制，并在经历不同炎症状态的牛中验证。