全自动连续流多肽合成仪，通过在线 UV 监测，实现 Fmoc 脱保护过程“实时可见”

Fmoc（9-芴甲氧羰基）是固相多肽合成（SPPS）中最常用的保护基，精准监测 Fmoc 脱保护反应，对保障多肽合成的质量与效率至关重要。在每一轮偶联循环结束后 Fmoc 必须完全脱除，才能保证最终多肽产物的高纯度与高收率。脱保护不完全会引发肽链终止、缺失序列等问题，最终造成合成整体效率和纯度降低。

PeptiPilot 是一款基于连续流技术的台式全自动多肽合成仪，其内置紫外（UV）检测系统，可实时监测 Fmoc 的脱保护过程，并输出关于脱保护完全度及合成表现的相关数据。

PeptiPilot 进行 Fmoc 监测的原理和过程

PeptiPilot 的内置在线 UV 检测器，会在每一步脱保护过程中，对柱反应器流出液，按照用户设定的 4 种不同波长持续采集吸光度信号。得到的吸光度曲线可实时反映脱保护反应进程。Fmoc 脱保护通常采用含 20% 哌啶的二甲基甲酰胺（DMF）溶液完成。反应释放出的二苯并富烯（DBF）及其哌啶加合物，在 301nm 处存在吸收峰。监测该波长可近乎定量检测 Fmoc 的脱除水平。

采用PeptiPilot 进行 Fmoc 脱保护监测，其过程分为 3 个阶段，用户可在 PeptiSoft 软件中对每个阶段的参数进行独立设置。

01 哌啶 / DMF 流过阶段

软件会根据用户设定的 UV 阈值，自动调整该阶段时长；

02 可选的停流阶段

用于延长哌啶 / DMF 溶液与树脂-结合多肽的接触时间，为较难脱保护的反应留出充足反应时间，以实现反应完全。

03 DMF 洗涤阶段

洗涤量为预设的柱体积（CV）数，或直至达到设定的 UV 终点。

案例：采用 PeptiPilot® 对司美格鲁肽合成过程中 Fmoc 脱保护进行监测

采用 PeptiPilot 对司美格鲁肽合成过程中的 Fmoc 脱保护进行监测。下图展示了第 8、9 连续两轮合成循环中 Fmoc 脱保护的典型 UV 曲线：阶段 1 加入哌啶/DMF 溶液后，UV 吸收快速上升，对应 Fmoc 基团脱除到达峰值，随着 DBF 及其加合物被洗脱，吸光度逐步回落；Fmoc 脱除峰出现之后，进入 10 min 停流阶段（阶段 2），图中表现为水平直线，该阶段保证脱保护反应充分进行；随后进入阶段 3，使用 4 CV DMF 洗涤树脂。

对比第 8、9 轮循环的监测曲线显示：第 9 轮循环的哌啶/DMF 流过阶段（阶段1）耗时明显更长，说明该轮脱保护反应动力学更慢。第 9 轮洗涤阶段起始位置出现额外脱保护产物峰，说明阶段 1 脱保护并未完全完成。

对全部合成循环的累积 Fmoc 脱除进行监测，可用于评估合成表现、脱保护动力学与收率（图3），为工艺开发及放大生产提供有价值的过程信息。对每一轮合成循环，分别绘制脱保护峰积分面积（图3，蓝色）以及阶段 1 的脱保护时间（图 3，橙色）曲线。所有数值与第一次 Fmoc 脱除结果做归一化处理，将其设定为 100%。

结果显示：第 8、9 轮循环中阶段 1 脱保护时间差异显著，第 8 轮为120%，第 9 轮为 227%，证明第 9 轮脱保护速率显著下降。脱保护时间的增加可能与肽链聚集相关。第 10 轮循环中，该数值进一步升高至 272%。此后，在合成后期观察到此数值逐步回落，说明聚集效应有所减弱，但仍然存在。积分峰面积对应被脱除 Fmoc 基团的量，可对脱保护效率开展半定量对比评估。最后一轮脱保护的峰积分面积，可用于整体合成性能与最终收率的重要参考指标。

PeptiPilot 在 Fmoc 脱保护监测中的优势

 实时在线数据采集

连续 UV 监测，直观获得每一轮循环脱保护动力学及评估脱保护峰形。

 工艺可量化

峰积分可辅助收率估算和追踪脱保护效率。

 可重复性

通过 UV 吸光度阈值精准输送脱保护试剂，获得可重复的脱保护与合成结果。

 易于使用

PeptiSoft 软件可便捷控制全部合成参数，包括合成过程中 Fmoc 脱保护相关设置。

欲详细了解采用 PeptiPilot® 如何对 Fmoc 脱保护过程进行实时监测，请点击链接，索取采用 PeptiPilot® 实时监测 Fmoc 脱保护的应用说明>>

PeptiSytems全自动连续流多肽合成技术的优势

• 合成时间缩短 50-90%，生产力提高 10 倍

仅需 1-3 天（vs 3-4 周）即可完成多肽的合成。可提高生产力、提高工厂产能、降低成本并缩短交付时间。

• 提高产品纯度和收率（~15%）

以更低的生产成本获得更多的产品！

• 节省成本，低氨基酸当量消耗，溶剂消耗量减少 50-70% 

每年可节约可观的成本。 

• 连续实时监测增强了合成控制，并实现了每个合成步骤的自动化

不再需要手动加样。

• 更容易扩大规模，进一步节省时间和成本

在中试规模上进行工艺开发，可直接使用相同的优化好的合成参数进行大规模合成（高达 5 mol）。

• 减少碳排放和环境足迹

减少溶剂消耗，可降低高达 50% 的 CO2 排放量，这意味着每台仪器每年可减少 100 吨CO2 排放量。

PeptiPilot® 桌面型全自动连续流固相多肽合成仪

PeptiPilot 是一款采用连续流技术的全自动固相多肽合成仪。该仪器为结构紧凑的泵驱动系统，适用于 0.1–16 mmol 的小规模合成。在PeptiPilot 上开发完成的合成工艺，可直接线性放大至 PeptiPro 生产级型号，实现无缝衔接生产。PeptiPilot 专为多肽合成工艺开发及多肽小规模生产而设计，可满足多种合成化学体系的需求。

PeptiPro® 生产级全自动固相多肽合成仪

PeptiPro 同样是一款采用连续流技术的全自动固相多肽合成仪。该仪器适用于 10 mmol–5 mol 大规模合成，支持 GMP 级与非 GMP 级多肽的生产。合成工艺可先在 PeptiPilot 仪器上完成开发与优化，再转移至 PeptiPro 进行规模化生产。PeptiPro 专为多肽大规模生产而设计，可满足多种合成化学体系需求。

基因有限公司作为PeptiSystems公司的中国区代理商，为您提供专业的基于连续流技术的全自动多肽合成仪和寡核苷酸合成仪的技术咨询、性能验证、安装及技术培训等。欲了解更多关于 PeptiSystems 全自动连续流固相多肽合成技术的信息，请扫码联系基因有限公司产品经理。