摘要
    Apo-ONE™均质Caspase-3/7检测方法的灵敏度高，用途广泛，准备所需试剂的时间很短。系统内在的灵活性能满足广范围检测体积变化的需要，并可以在Beckman Biokmek(r) 2000上进行自动化高通量Caspase检测。Apo-ONE™检测方法提供的试剂经优化，可以在细胞水平，也可以在纯化的酶系统中，检测细胞凋亡。这儿我们介绍了在96孔和384孔板的规格中，使用Apo-ONE™均质Caspase-3/7检测系统，来筛选诱导细胞凋亡的潜在治疗药物。

引言
    细胞凋亡是指发生在多细胞生物的正常发育，生长和组织内恒定中调控细胞死亡的一种形式。对细胞表面的致死受体进行刺激或从线粒体中释放细胞色素C均可以激活细胞凋亡。在这些信号所起始的级联反应中，半胱氨酸天冬氨酰蛋白酶，或称为Caspase的蛋白酶，从无酶活的酶原，经切割，形成有活性的异源二聚体。活化的Caspase降解了几个细胞存活所需的关键组份，比如DNA修复因子，结构蛋白和细胞信号多肽（1）。Caspase-3是主要的致死效应分子，可以作为检测细胞凋亡的主要靶点，通过刺激位于细胞表面上的死亡受体和线粒体中细胞色素C的释放可以激活Caspase-3（2）。
由于将调控细胞凋亡的信号阻断后，可产生多种病理症状，故细胞凋亡成为药物开发及治疗方案确立中的热点领域。比如，抑制细胞凋亡的化合物可以用来治疗如帕金森症这样的神经退化疾病（3）。相反，诱导细胞凋亡的药物可以用于治疗肿瘤。Apo-ONETM均质Caspase-3/17测试方法，在高通量筛选活性化合物的实验中，速度快，通用性高。

一步，细胞水平的Caspase检测
    将Promega独创的Lysis/activity缓冲液与Z—DEVD—罗丹明110底物配合使用，可以在附着，悬浮或原代培养的细胞中，用这种灵敏的，单步试剂来检测Caspase-3/7。这种单步均质Caspase-3/7试剂消除了其他Caspase检测系统

中的多轮冻融步骤，并极大地减少了获取有效数据所需要的时间。只要将均质Caspase-3/7试剂和培养基中的细胞按1:1进行混合，测试的样品体积可以进行变动，无论是较大或较小的样品体积均适用。

灵活及容易使用
    为了证明系统的灵活性，我们将人Jarkat细胞培养在96或384孔板中，并在Biomek(r)2000仪器上进行测试。我们还在384孔板的规格中，模拟了药物筛选的流程，并测试了几种诱导细胞凋亡的化合物。为了充分揭示系统的灵敏度，我们比较了与Apo-ONE(r)均质Caspase-3/7检测法配套的Z-DEVD-罗丹明110底物，及另一种常用的Ac-DEVD-AMC底物，检测在96孔板中进行，并使用了均质Caspase-3/7缓冲液。

在最短的时间中获取可靠数据
    图1, A图，显示了用96孔板进行测试，由抗Fas单克隆抗体诱导的Jurkat细胞，及非诱导细胞，获得的数据。发生凋亡的细胞（诱导）和非诱导的Jarkat细胞之间，在加试剂后1小时，就能显示出明显的差别。将细胞在Caspase试剂中的保温时间延长，我们可以进一步提高测试的灵敏度（图 l, B图）。如果用很少的细胞数目或者活性Caspase-3/7表达水平很低的细胞进行测试，并得到有效数据，就需要与均质Caspase-3/7试剂进行较长时间的保温。

    许多Caspase测试方法使用含7-氨基-4-甲基苯并呋喃（AMC）的荧光多肽底物，但是Z-DEVD-罗丹明110在短时间的保温过程中，灵敏度比Ac-DEVD-AMC有明显优势。即使使用625个细胞进行测试，在1小时内，与Z-DEVD-罗丹明110底物保温的用抗Fas单克隆抗体诱导的细胞和非诱导的细胞间，就能观察到明显的差别（图2）。但是，将同样经过处理的细胞群与AC-DEVD-AMC底物进行保温，诱导和非诱导的细胞间却无明显差别，只有将细胞的数目增加到2,500时，才观察到诱导和非诱导的细胞间的差别。

    图3显示了用384孔板筛选潜在细胞凋亡诱导物的代表性数据。<转下一页>