快而精：聚焦转染3大品牌之Qiagen篇[选购宝典]

生物通技术测评    话说罗氏收购德国宝灵曼后一跃成为诊断领域的一哥，在这个满地黄金的领域里数钱都忙不过来，难免有点顾不上科研市场了－－尽管原来的宝灵曼在科研领域业同样出色，无奈一直不是Roche发展的重心。转染市场上FuGENE 6这个狮子打盹的时候，一个新来者悄悄崛起了，这就是Qiagen。也许是凭借着超纯质粒纯化和去内毒素等专为转染需求而设计的质粒纯化产品的良好口碑，Qiagen的转染试剂迅速得到了很多用户的认可，短短几年内就成功跻身于最常被文章引用的3大转染品牌之一（分别是Invitrogen，Roche，Qiagen）。Qiagen公司显然并不满足于在核酸纯化领域的称霸（见生物通 质粒提取技术篇），核酸合成领域和亚洲市场的一系列动作，蛋白组研究和RNAi等领域不断的新品推出等等，都彰显其决心和实力。

    Qiagen的一贯特色就是“快而精”，在中国的注册公司也是这个名字：快而精。第一次听到Qiagen变成这么“通俗”而彻头彻尾中国化的名字时，真是大吃一惊又好笑！不过转头细想，这个名字不单表达Qiagen的正确发音，确确实实表达了Qiagen的理念：Qiagen一直在努力追求“更快”，“更精”－－比如核酸纯化，每种需求分得很细，所以设计出的产品就很“专”，很“精确”地配合用户的需求。转染也不例外：根据转染的对象和目的不同，Qiagen的6种转染产品可分为RNA转染和DNA转染，其中以RNAi转染的产品最为出色。

  RNA转染 

    RNA干扰技术（RNAi）由于在研究基因功能领域的巨大潜力而成为发展最迅猛的技术之一，各大生物技术公司纷纷推出了很多RNAi产品，Qiagen也不例外。因为Qiagen深知，siRNA转染不同于DNA转染，即使是转染效率的细微差别，都很有可能会直接影响基因沉默的效果，从而影响最后的实验结论。 

    TransMessenger是第一个专门为转染RNA而设计的脂质型转染试剂，原理是借助专利的促RNA凝聚剂（RNA-condensing enhancer）将松散的RNA分子“团结起来”，在RNA分子外加上一层“保护膜”，保护RNA穿越细胞膜从而实现RNA的转染。作为早期的RNA转染试剂，TransMessenger操作比较麻烦，转染前后都要更换培养基/洗细胞－－因为转染要求在无血清无抗生素的条件下进行，以避免血清中RNAse污染而影响转染实验。在更好的产品推出后 TransMessenger依然有自己的市场，原因在于除了常规的RNA转染，TransMessenger还可以用于基因沉默实验中的siRNA和质粒DNA共转染实验。特别值得注意的是 TransMessenger同样适合转染非分裂期的细胞，以及常用的293, BSC-1, MA104, MRC, Primary cortical and hippocampal cells, TRM-6 and TRM-6/PDX-1 cells, TU7D, Vero在内的多种细胞。

    不同的转染目的，最适合的细胞生长期是不同－－ TransMessenger有明显体现－－如果转染RNA，转染时细胞的汇合度应为80%-90%，而如果是siRNA转染，那细胞的汇合度建议为50%-80%。TransMessenger目前的价格是2700/0.5ml，每次8微升用量，足够做60次6孔板转染，价格不算便宜。对于siRNA转染实验，早期的TransMessenger显然还不够Perfect，所以Qiagen又专门为siRNA转染设计了新的RNAiFect和HiPerfect，绝对是更好的选择。

    RNAiFect专门为RNA干扰而设计，令siRNA的转染简化到比DNA转染还要方便：因为RNAiFect不怕血清，也不怕抗生素，即使是稀释siRNA和转染试剂的过程中也可以用含血清或者抗生素等添加剂的完全培养基——厉害吧？你可以想象RNAiFect的确是真正的超低毒性－－这个优点的重要好处在于，你可以在完全一致的条件下进行siRNA转染并观察结果－－因为RNAi实验需要观察siRNA转入细胞后对目的基因的沉默效果，而基因的作用是相互关联的，在转染前或者转染后细胞培养环境的改变－－比如培养基的成分改变－－无论是减少抗生素、添加剂或者是血清，都有可能影响细胞内部环境，从而间接影响某些基因表达和相互作用，间接影响实验结果。用RNAiFect就没有这个顾虑，因为转染全过程都可以用同样的完全培养基，增加的只是siRNA而已。RNAiFect转染简单到4步骤：培养细胞到60—80%汇片，用完全培养基稀释siRNA，加入转染试剂温育，加入细胞培养并检测。这是唯一一个可以用含抗生素的完全培养基全程操作的siRNA转染产品。

    RNAifect价格在众多的RNAi专用转染试剂中实在不算贵，0.5ml转染试剂1470元，1ml包装的2300左右。24孔板每次用6ul转染试剂，1ml可做170次转染。关键是好用。通常保存在4度，允许15—25度室温运输和使用（不用插冰盒）不怕氧化。

    这还不够完美。对于一切都在“加速”的今天，高通量技术使得研究人员可以站在更高的层次上更快得到“全局”的结果，因为一次可以同时进行成百上千的实验。为了让siRNA转染也能够适应高通量的潮流，Qiagen又推出了更加独特的HiPerfect。    

    siRNA抑制效率非常高，自然世界中只需要极少的siRNA就足够了，siRNA决非越多越好。可是多数转染试剂都要求较高浓度的siRNA——浪费了宝贵的siRNA，而且还容易引起“脱靶反应”（off-target effect）——大量的siRNA进入细胞会影响其他非同源或者部分同源的基因的表达——包括非特异mRNA降解，非特异翻译抑制，非特异干扰素反应。目前“脱靶反应”机制并不清楚，但是显然这会影响实验的结果和可靠性。研究表明低浓度siRNA转染有助于避免这种现象。

    Qiagen最新推出的RNAi专用转染试剂：HiperFect可以在siRNA低至100pM浓度的条件下转染（推荐浓度是1nM-5nM，根据资料，1nMsiRNA抑制效率可达86%而5nM可达96%），保持高效基因沉默的同时减少副反应的危险，正是这一产品的精髓所在。HiperFect转染试剂的方便程度也是独一无二的——你甚至可以在一天内完成整个接种到检测结果的转染实验，这对于高通量反应简直是求之不得的福音：转染前将细胞按比例接种到24孔培养皿中，培养基可以是含有抗生素和血清的，在37度培养箱中保温。用无血清培养基稀释siRNA，加入HiperFect转染试剂混匀并温育5—10min，将混合物逐滴加入培养皿中混匀，培养细胞直到适当的时候检测基因沉默效果。一天之内可以完成再次接种、转染到检测结果！厉害吧！更厉害的还在后面：这个快速操作流程简便到还可以用于“反向转染”——就是在siRNA矩阵（比如siRNA芯片）上分别点加转染试剂和细胞，就可以在siRNA矩阵列上培养一小个一小个的转染细胞！当然，习惯用传统方法也是可以的，只要培养到细胞汇合度50%—80%进行转染就可以了。HiperFect真的是将实验简化到最简了，没有禁用血清、抗生素的困扰，实验真是方便极了。就是价格稍贵，目前0.5ml的试剂报价要2800，可以做170次24孔板转染（每次3ul），但是如此方便而高效的产品，就是最好的回报啦。HiperFect通常保存在4度，允许15—25度室温运输和使用（不用插冰盒），不怕氧化，很方便。

    Qiagen的东西向来都定位在“优质优价”上，令人切齿:(  好在每年Qiagen都会有2次特价活动，折扣不错的，留意生物通特价专栏就可以及时得到活动信息。

 DNA转染 

    PolyFect是Qiagen产品中少见的便宜货，这个专门为5种常用细胞系高效转染而设计的DNA转染试剂最大的特点就是，只为COS-7,NIH/3T3,Hela,293,CHO这5种细胞专门优化，所以转染效率特别高，关键价格还特便宜。PolyFect集中体现了Qiagen“快而精”的特点。1ml不到1900多元（可以谈折扣的哦），足够做100次6孔板转染或者300次以上的24孔板。而且全程转染可以用含血清或者抗生素的完全培养基进行－－PolyFect不怕血清也不怕抗生素，操作可谓方便。如果你正好只用这几种细胞系，OK，PolyFect是最佳之选。

    无论是lipids还是liposome，脂质类转染试剂一直是不可忽视的重要力量。Effectene是第二代的脂质类转染试剂，新，就在克服脂质类转染试剂怕血清和抗生素的缺点，使得细胞毒性大大降低的同时转染效率提高。由于转染效率更高，所以Effectene不需要太多DNA，只要通常用量的5分之一就可以得到不错的结果－－对于24孔板一次只需要0.2ugDNA，35mm板也只需要0.4ugDNA就足够了。新的Effectene也是特别方便的设计，用Kit里的enhancer和DNA混合，加转染试剂温育，然后加有血清和抗生素的完全培养基稀释，就可以直接加入有血清和抗生素的培养体系中了。由于不会象常规脂质体那样提高了细胞通透性而导致不能在转染过程中使用抗生素或者添加物，Effectene不需要去掉培养基中的抗生素血清或者其他添加物，可以保持细胞培养环境的稳定，对使用者来说可以省掉一些不必要的操心。Effectene特别适合原代细胞和敏感细胞转染，就是价格不便宜啊，1ml要3900多，可以做100次35mm培养皿，或者是200次24孔板。好用，效率高，如果“老革命遇到新问题”，新的细胞系用原来的方法不管用，Effectene值得尝试。

    SuperFect是一种技术的革新尝试，完全不同于脂质类的转染产品，主要成分是活化的dendrimer（树枝装聚合物）－－“dendrimers”这个词来自希腊语”dendros”,意思是树和枝，树上的分枝长到一定长度后又分成两个分枝，如此反复，直到长得稠密得象球形一样的树丛。SuperFect的活化dendrimer分子，分枝是内部连结的高分子聚合键，每一个键又会产生新键，全部会向一个焦点聚合或向一个核聚合；末键端象毛线球上的绒毛，是带正电的氨基酸，可执行特殊的化学功能－－结合DNA并形成较为致密的、带正电的复合物，可以和细胞膜上带负电的膜受体结合，一旦进入细胞膜后，dendrimer结合内吞小泡并调节溶酶体pH值从而抑制其中核酸酶活，稳定外源DNA。这种创新的成分对某些细胞系特别管用。SuperFect在和DNA形成复合物时要用TE而不要用有血清的培养基，后面的步骤就可以用有血清或者抗生素的完全培养基来稀释和转染（血清的存在会显著提高转染效率）。这种真正运用了“纳米技术”的转染试剂3395/1.2ml包装可以做120次35mm板转染或者240次24孔板转染。dendrimer因为内部结构可形成有别于外环境的通道，也许将来有望在细胞膜上建立特殊通道，当然，这是转染题外话了。（生物通编辑部）

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