RNAi实验用户手册中文版(I)[选购宝典]

RNAi技术已经进入了生物科学研究的许多领域，成为了一种主要的生物学研究工具，发展得相当迅速，并受到了此次诺贝尔奖评审委员会的青睐，获得2006年诺贝尔奖医学/生理奖。然而这一才历经十个年头的技术依然对于许多研究人员来说还是很陌生的，生物通编译收集了一些研究文章和综述，聚焦RNAi技术最常见的一些问题，希望能给国内已经从事或希望接触RNAi实验的研究人员以帮助。

RNA干扰（RNA interference, RNAi）是由双链RNA(double-strandedRNA，dsRNA)引发的转录后基因沉默机制，这种真核生物中普遍存在的抵抗病毒入侵、抑制转座子活动、调控基因表达的监控机制目前已成功用于基因功能和信号转导系统上下游分子相互关系的研究。随着研究的不断深入，RNAi的机制正在被逐步阐明，而同时作为功能基因组研究领域中的有力工具，RNAi也越来越为人们所重视。

目前这一技术已经进入了生物科学研究的许多领域，成为了一种主要的生物学研究工具，发展得相当迅速，并受到了此次诺贝尔奖评审委员会的青睐，获得2006年诺贝尔奖医学/生理奖。然而这一才历经十个年头的技术依然对于许多研究人员来说还是很陌生的，生物通编译收集了一些研究文章和综述，聚焦RNAi技术最常见的一些问题，希望能给国内已经从事或希望接触RNAi实验的研究人员以帮助。

第一章：如何挑选特异有效的siRNA？

第二章：如何挑选RNA干扰系统？

第三章：体内shRNAs表达，shRNAs文库构建

第四章：全基因组loss-of-function腺病毒RNAi文库构建

　

Chapter I  如何挑选特异有效的siRNA？

小分子干扰RNA（siRNAs）已经广泛的用于序列特异性基因敲除，在脊椎动物细胞基因功能检测，以及作为治疗性药剂方面发挥着越来越重要的作用。

但是要挑选特异并且有效的siRNAs并不是一件容易的事情，这主要是由于并不是所有的与靶标mRNA同源的siRNAs都能有效，而且target-complementary siRNAs也会非特异性地靶向其它的mRNAs（包含与siRNAs部分互补的片段序列），虽然目前已经有了大量计算机工具生物信息学的辅助，然而在操作上挑选siRNAs仍然有一些要注意的地方。

一、siRNA筛选总论

1. 靶标mRNA分析

靶向目标基因的siRNAs筛选一般从靶标mRNA注释序列开始，主要包括5’和3’非翻译区（UTRs），剪切，多态性和等位基因突变。由于编码基因的mRNA序列信息是最可靠，因此常以此来作为靶标，而UTRs通常了解的比较少，但也可以利用相似的基因敲除率（gene-knockdown efficiency）来靶定。当然，虽然UTRs常被推荐用于避免包含有mRNA结合蛋白的绑定位点，比如the exon-exon连接复合物等，但是在这个方面并没有详细的实验数据。

因此出于操作的考虑，siRNA的筛选有许多额外的限制，比如分辨出靶标orthologs（指起源于不同物种的最近的共同祖先的一些基因）的是来自一个以上的物种还是一个基因的所有可能的剪切突变。

2. 已公布和有效的siRNAs数据搜索

在以下可以找到一些实验验证的siRNAs序列，

Ren, Y. et al. siRecords: an extensive database of mammalian siRNAs with efficacy ratings. Bioinformatics 22, 1027–1028 (2006).

Chalk, A.M., Warfinge, R.E., Georgii-Hemming, P. & Sonnhammer, E.L. siRNAdb: a database of siRNA sequences. Nucleic Acids Res. 33, D131–D134
(2005).

Truss, M. et al. HuSiDa–the human siRNA database: an open-access database for published functional siRNA sequences and technical details of efficient transfer into recipient cells. Nucleic Acids Res. 33, D108–D111 (2005).

除此之外，从一些商业来源也可以获得有效的siRNAs（比如Qiagen的HP validated siRNAs，Ambion的the Silencer validated siRNAs），而且像Qiagen这样的公司也提供预制的siRNAs和顾客定制服务。当然也要提醒一下，虽然这些预制试剂能提供很好的RNAi实验结果，但是还是要检测这些siRNAs是否有效和对于自己是否合适。

　

3. 挑选运算方法和siRNA序列筛选工具

近年来，在固有序列和稳定的功能性siRNAs的研究基础上已经发展出了几种siRNA序列筛选运算规则，其中一小部分考虑到了二级结构和靶标mRNA的可行性（是否容易获得），而且这些运算规则的方法涉及到了从完全经验性的观察到熟练的机械计算的各种范围。

在从靶标mRNA序列中筛选出siRNA序列后，每一个候选的siRNAs都需要在全基因组水平上验证是否会与无意中被靶定的其它mRNA转录本相似。大部分的运算规则都包含各种这样的程序，以下是一些网站列表。

（点击看大图）

4. siRNAs验证

因为要确定每一个siRNA基因敲除的精确水平是一个严格要求的过程，而且对于新的靶标基因又需要各种实验，所以以融合报告系统为基础的实验可以加速在不同的合成的siRNAs中识别有效的siRNAs。

在这些系统中，可以利用包含靶标序列和融合报告基因，以及用于标准化的对照基因的质粒，联同靶标特异性siRNAs共转染进细胞中。这里要提一下来自Promega公司的以双荧光素酶（dual-luciferase）为基础的siCHECK系统，这种系统应用广泛，可以在24小时内得到siRNAs活性的ranking，方便快捷（这些以报告系统为基础的 activity通常与内源性靶标剔除的有效性有关）。利用这些预证siRNAs可以用于验证内源性靶标mRNA的沉默，详细的内容可以参考这篇综述：Cullen, B.R. Enhancing and confirming the specificity of RNAi experiments（Nat. Methods 3, 677–681 (2006)）。
（未完待续）

RNAi实验用户手册中文版(II)

(生物通：张迪）