蛋白质组研究第一步:双向电泳蛋白样品制备[选购宝典]

【字体: 时间:2006年02月13日 来源:生物通

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生物通新技术专栏之蛋白质组学技术专题 

   开篇之际,首先来看看这两句话:
“在制备中丢失的蛋白是永远不可能在后面的实验中弥补回来的”,
“让我们把蛋白质看作是具有独特而奇妙性质的实体”。

    在直击蛋白质组学研究技术全过程 一文中就提到过,目前蛋白质组学研究主要是两条互补的实验工作流程——基于凝胶的工作流程(Gel-based workflow)和基于液相色谱的工作流程(LC-based workflow)。其中对于前者而言,双向电泳技术是核心,而这核心中的核心就是电泳的第一步:蛋白样品制备。这是因为不像双向电泳的其它过程有仪器,有大致相似的操作程序,蛋白样品由于其结构特性各异,又必须使其完全溶解和尽可能少的化学修饰,所以不可能有一个通用的技术,只能通过大量的实验来积累经验。正如开篇所引用的两句话中包含的深意:在研究蛋白的过程中,既需要严谨的技术流程,规范的操作手段来确保蛋白研究的完整性,也需要将其看成是独特而奇妙的个体,结合以往经验但又不拘泥于经验,才能真正揭开她神秘的面纱。

为什么要进行样品制备

    “为什么要进行样品制备?电泳的目的不就是分离吗?”刚接触双向电泳的小菜鸟有可能就会这么问。这个问题很好回答,这是由于目前双向电泳一般只能分辨到1000-3000个蛋白质点(spot),而样品中的蛋白种类可达到10万种以上,因此样品的制备是必须的。另外比如像对临床组织样本进行研究,寻找疾病标记的蛋白质组学研究目的,由于临床样本都是各种细胞或组织混杂,而且状态不一,如肿瘤组织中,发生癌变的往往是上皮类细胞,而这类细胞在肿瘤中总是与血管、基质细胞等混杂。所以常规采用的癌和癌旁组织或肿瘤与正常组织进行差异比较,实际上是多种细胞甚至组织蛋白质组混合物的比较,而蛋白质组研究的通常是单一的细胞类型,因此需要进行有效的样品制备。

    但是为什么要进行不同步骤的样品制备呢?这不仅仅是由于蛋白本身不同,所以需要不同方法来配合,而且在制备样品的时候,首先需要明确的是什么是实验的最终目的:是分离尽可能多的蛋白还是分离样品中某些感兴趣的蛋白,这些直接决定了你的制备方法,也决定了实验的成功与否。由于想要分离的蛋白必须是完全溶解的,溶解的效果取决于裂解、破碎、沉淀、溶解的过程以及去污剂的选择和各种溶液的组成,因此如果是只对样品中的一部分蛋白感兴趣,可采取预分离的方法,如欲分析的蛋白来自细胞器(细胞核、线粒体和原生质膜),则应先采取超速离心或其他方法将细胞器分离出来再溶解蛋白;如果是希望分离出尽可能多的蛋白,比如进行全蛋白质组分析,则可以将细胞或组织中的蛋白分成几部分,分级制备。

样品制备的原则

  1. 应使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态(包括多数疏水性蛋白),且制备方法应具有可重现性。

  2. 防止样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀。

  3. 防止在样品制备过程中发生样品的抽提后化学修饰(如酶性或化学性降解等)。

  4. 完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白。

  5. 尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白,从而保证待研究蛋白的可检测性。

    以上这五项原则是根据北大人类疾病研究中心讲座内容改编而来,基本上可以说是囊括了样品制备过程中的抽象注意事项,之后还会提到具体的注意事项。


样品制备流程

    蛋白样品制备过程简而言之就是三步:破碎、沉淀蛋白和去除杂质。虽然说出来不过寥寥的十个字,但是这几个过程经过这么多年,还没有那位研究人员可以说自己已经完全掌握,面对任何蛋白制备手到擒来。

破碎——最小限度的减少蛋白水解和其它形式的蛋白降解原则

    样品制备的第一步当然是细胞或者其它样品的破碎,这一步看似简单,但是操作中一旦方法不当,就有可能会丢失样品中的蛋白和导致蛋白被修饰。要想毫发无损的通过这一关,首先就要分析样品的来源,是易碎的细胞还是坚硬的组织?是植物细胞还是真菌?要做到有的放矢,才能事半功倍。

    破碎的方法有许多种,包括循环冻融法、渗透法、去污剂法、酶裂解法、超声波法、高压法、液氮研磨法、机械匀浆法和玻璃珠破碎法等(可以归纳为机械法、化学法和物理法),这些方法有不同的应用范围,但基本的原则都是要以最小的限度减少蛋白水解和其它形式的蛋白降解,这也就是在样品制备破碎这一步的关键所在。

    就这些方法具体而言,选择的时候如果是较易破碎的细胞组织,就可以采用渗透法,这种方法十分温和,适用于血细胞和组织培养细胞。而对于细菌细胞,则可以采用冻融法,利用液氮一次或者多次反复冻融来裂解细胞。去污剂法适用于组织培养细胞,将样品悬浮于含有去污剂的裂解液中,可以溶解细胞膜释放内含物,如果裂解液中含有SDS,为了不干扰等电聚焦,可以将裂解的样品用含有过量的非离子或者两性离子去污剂的溶液稀释,或用丙酮沉淀法去除SDS。另外酶裂解法适用于植物组织、细菌和真菌细胞。

    除了这几种较温和的方法,一些较剧烈的方法也有自己的适用范围,如超声波法适用于细胞悬浮液,高压法常用于有细胞壁的微生物,研磨法适用于微生物和组织,而机械匀浆法是机体软组织破碎最常用的方法之一,玻璃珠破碎法则用于细胞悬浮液和微生物的破碎。

    为了确保在这些方法过程中减少热量的产生,可以在低温(冰浴或者液氮)下操作,并且由于在破碎过程中会产生蛋白酶,使蛋白水解,因此也要注意在含有蛋白酶抑制剂的裂解液中进行。

沉淀蛋白 ——可溶性是关键

    一般而言,在破碎样品获得蛋白之后常常需要通过蛋白沉淀去除干扰物质和浓缩样品,在这个步骤中重点是要获得可以重新溶解的蛋白,因此对所研究的具体蛋白的特性需要有详细的掌握,这也是体现研究人员工作能力的“check points”。

常见的蛋白沉淀方法有以下几种:

沉淀方法 原理 方法  优点 缺点
硫酸铵沉淀法 高盐浓度的缓冲液促进蛋白聚合沉淀  在蛋白终浓度大于1mg/mL并含有EDTA的缓冲液(>50mmol/L)将硫酸铵加至饱和,搅拌10-30分钟,离心分离 预分离 不能得到全部蛋白,并且残留的硫酸铵和核酸会影响等电聚焦
三氯醋酸(TCA)沉淀法   在蛋白溶液中加入TCA,使其终浓度为10%-20%,冰浴30分钟。    被沉淀的蛋白难再溶解,并且长时间将样品置于这种低pH溶液中会引起蛋白降解和修饰
丙酮沉淀法   在蛋白溶液中加入3倍体积的预冷丙酮,20℃沉淀2小时,离心收集蛋白。    
TCA-丙酮沉淀法   用含20mmol/L DTT或0.07%β-巯基乙醇的10%TCA溶液20℃沉淀45分钟以上,离心收集,再用20mmol/L DTT 0.07%β-巯基乙醇清洗,空气(冷冻)干燥。 双向电泳常用方法   
醋酸铵沉淀法    用醋酸铵的甲醇溶液沉淀,再用酚抽提,0.1mol/L甲醇清洗,再用丙酮清洗。 适用含有大量干扰物质的植物样品 步骤繁琐


去除杂质 ——关键是尽量不丢失蛋白和减少蛋白修饰

    在样品中常常会含有像核酸、多糖、去污剂和代谢物等非蛋白质杂质,需要去除,否则会影响双向电泳的结果,这个过程有时会造成蛋白的丢失以及蛋白的化学修饰和解聚,特别是后者会导致双向电泳图谱中蛋白点的增多(由于电荷的改变),所以操作中要多加注意。

1. 核酸的清除
Ø 对电泳的影响:增加样品粘度、与蛋白质形成复合物后会出现假象迁移和条纹。
Ø 解决的方法:用适量纯的不含蛋白酶的核酸内切酶进行降解,或是利用合成载体两性电解质(SCA)同核酸结合形成复合物的能力,再通过超速离心来去除复合物。

2. 多糖的清除
Ø 对电泳的影响:带负电的多糖会与蛋白形成复合物,导致拖尾和影响聚焦。
Ø 解决的方法:利用超离心和高pH,高离子强度,和TCA等沉淀法。

3. 去污剂的清除
Ø 对电泳的影响:SDS能与蛋白形成带负电的复合物,对等电聚焦影响大,需要清除。
Ø 解决的方法:用含载体两性电解质或两性离子去污剂(CHAPS、Triton X-100或NP-40)的溶胀液稀释,或者丙酮沉淀法。

4. 盐离子和外源带电小分子的清除
Ø 对电泳的影响:样品中的盐会增加凝胶条的电导,使其无法达到设置的电要,从而影响蛋白质聚焦,带电小分子会引起水的流动,使胶条的一端肿胀而另一端变干,导致两端的酸、碱性蛋白无法聚焦,造成拖尾或丢失。
Ø 解决的方法:常用透析去除盐成分,TCA-丙酮沉淀法可以清除小分子。


样品制备注意事项

1. 蛋白质水解
    当细胞破碎的时候,蛋白水解酶就会被释放出来或被激活,使双向电泳结果复杂化,影响最终结果分析。为了避免这些情况的出现,建议在样品制备时尽可能在低温下进行。此外,许多蛋白酶在pH9以上就失活了,因此Tris碱,碳酸钠或碱性载体两性电解质往往能抑制蛋白水解。但是有些蛋白酶在上述条件下仍然保持着活性,此时应当使用蛋白酶抑制剂。每一种蛋白酶抑制剂只对某一类蛋白酶起作用,因此建议复合使用蛋白酶抑制剂,如广谱蛋白酶抑制剂“鸡尾酒”,见下表(来自《蛋白质电泳实验技术》)。

蛋白酶抑制剂 有效抑制的酶
PMSF(Pheylmethylsulfonyl fluoride)是很常见的抑制剂,使用浓度为1mmol/L  不可逆抑制丝氨酸水解酶和一些半胱氨酸水解酶。
AEBSF 丝氨酸抑制剂,使用浓度为4mmol/L  AEBSF的抑制活性与PMSF相近,但它更易溶于水而且毒性低
EDTA,EGTA,使用浓度为1mmol/L 通过鳌合蛋白酶维持活性所必需的金属离子来抑制金属蛋白酶。
多肽蛋白酶抑制剂,使用浓度为2-20ug/ml  亮肽素(Leupeptin)能抑制多种丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶;抑肽素(pepstatin)抑制天冬氨酸蛋白酶;抑肽酶(aprotinin)能抑制许多丝氨酸蛋白酶;苯丁抑制剂(bestatin)能抑制氨基酸多肽酶
TLCk,TPCK,使用浓度为0.1-0.5mmol/L  不可逆的抑制丝氨酸和半胱氨酸的蛋白酶
苄脒(Benzamidine)使用浓度为1-3mmol/L  抑制丝氨酸蛋白酶


2. 特殊样品的制备
    低丰度蛋白的分离:尽管增加上样量和提高总蛋白的溶解度能增加分离时的低丰度蛋白的量,但同时增加了高丰度蛋白的负荷,且造成蛋白的叠加效应而影响分离。现常用预分级+窄pH胶的微制备技术进行分离:即将总蛋白组分成蛋白质组亚群,再用pH梯度小于2个pH单位的IPG胶进行窄pH范围的分离。 

    强碱性蛋白质(如核糖体 )的处理:先将蛋白预处理以富集,再用特殊pH梯度的IPG胶条(如pH3-12、4-12或10-12)进行等电聚焦。其中窄范围碱性IPG胶(如pH10-12)的挑战是克服反向、阴极向阳极、电渗流和水平条纹模式,而宽范围的碱性IPG胶(如pH3-12、4-12)等消除了窄范围胶所需要的专门水化液。

    极端分子量的蛋白质:小于8kD和大于200kD的蛋白在常规IPG-2D上不易看到,这可能是在Tris/glycine缓冲液中,样品和游离的dodelcyl sulfate ions持续积累浓缩,与小分子量的蛋白质发生对流混合,产生茸毛状的或模糊的带,从而降低小蛋白的分辨率;在胶底端,高浓度的十二磺酸使蛋白固定致染色困难。至于高分子量蛋白少的原因可能是在变性条件下,蛋白质复合物变成了多肽,或者可能是大分子。

    除了以上这些,在纯化和浓缩了蛋白样品之后,许多研究人员就会直接进行电泳了,但实际上还有一个重要的步骤不容忽视,那就是定量,这对于蛋白表达量的研究尤为重要。(生物通:张迪)

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