蛋白功能研究新趋势：体外表达产品(上)[选购宝典]

【字体：大中小】 时间：2006年03月24日 来源：生物通

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生物通在前面介绍了体外表达的概况，那么，如果打算进行体外表达实验，具体有哪些产品可供选择，费用如何呢？我们在这里为您介绍一些主流产品和各自的特点。

Ecoli体外表达体系

我们在前面的文章中提到，由于体外表达的翻译后加工都存在一定的困难（我们会在后面介绍Promega在这方面提供的特殊产品），所大肠杆菌体外表达相对于其他真核体外表达的优势就显现出来而很快成为新热门。比如，大肠杆菌来源成本最低；真核体外表达需要给mRNA加上帽子结构，大肠杆菌就不需要；真核体系的转录和翻译是分步进行的，所以体外表达最好分步进行以优化条件，而原核的大肠杆菌体内这两个步骤本来就是偶联在一起同时进行的，所以用于体外表达的操作也更简单高效；另外大肠杆菌系统耐受性更高，可以在反应体系中添加分子伴侣、蛋白酶抑制剂、标记或者非天然的氨基酸等等，满足实验的特殊需要；此外原核体系用于表达真核蛋白时不会有内源干扰的问题等等。

而相比大肠杆菌体内表达，体外表达的优势在于：

需要转化筛选表达等功夫，只需要几个小时得到产物，速度更快操作更简单；
无细胞功能限制，可表达毒性蛋白
借助分子伴侣等外加分子促进产物可溶表达，减少包含体变性复性的麻烦
借助改变反应条件可得到含二硫键正确折叠的蛋白
可共表达多个基因产物
可进行同位素或者非放标记
可插入人工氨基酸研究蛋白质结构
可加入蛋白酶抑制剂抑制蛋白降解
可加入稀有密码子的tRNA解决稀有密码子问题

大肠杆菌体外表达一般都选用蛋白酶缺陷株裂解物，原因很明确，减少蛋白酶对产物的降解。可分两大类，一类是用于单个实验，一类是适合仪器的批量反应。

Promega S30系

Promega体外表达产品相当丰富，其中大肠杆菌体外表达的S30系列就是采用OmpT/Ion蛋白酶缺陷株。E. coli T7 S30 Extract System For Circular DNA是专门为带有T7启动子序列的质粒预备的；E.coli S30 Extract System有适用于环状模版和线性模版2种选择，前者只要是普通的大肠杆菌表达质粒就可以直接用，后者则可以是已经合成的RNA，或者是带有普通大肠杆菌启动子、核糖体结合位点和终止信号的DNA片断、PCR产物。Promega这一个系列还提供3种不同的缺减氨基酸混合物，各缺少一种氨基酸以备不同的标记需要，当然还有对照和检测试剂，所以使用起来相当方便——混合好需要的各组分和模版，37度保温1—2小时插冰上5分钟就OK啦。剩下的或PAGE电泳、Western检测、或者TCA沉淀纯化，该干吗就干吗去吧。

适用于质粒的体外表达体系常用于合成放射或者非放标记的蛋白质，快速鉴定克隆产物，或者加入非天然氨基酸来研究蛋白质结构，还有用于研究转录翻译机制的。而线性产物的试剂盒则更多用于直接鉴定PCR产物、诱变突变基因产物或者截断（turncated）蛋白质产物以研究功能域。Promega的产品平均下来一次反应成本100块上下，如果是标记蛋白这个方法可谓首选之一，如果你的表达只需要Werstern验证一下产物就可以，这个也是很不错的选择。

大肠杆菌体外合成中一个可能遇到的有点讨厌的问题是，真核基因里面可能有多个蛋氨酸(Met)，如果碰巧前面的序列正好类似大肠杆菌的核糖体结合位点RBS，就会由于起始位点错误而得到一些截短的副产物，比如Promega这个Kit里面的对照Luciferase，就有14个Met，其中有几个正好可以形成RBS，翻译的结果就会看到多了几条小带。碰到别理它就是啦，不就是多了点副产品而已。谁没有开小差的时候呢。大肠杆菌体系的另一个注意问题是序列必需要有原核的SD序列，就是核糖体结合位点，和相应的转录终止信号。真核体系能识别Kozak序列和原核的SD序列，软件的术语叫做向下兼容，可是原核的就不认识真核的Kozak序列了，没办法，谁叫它低级呢。

前面说过Ecoli体外表达系统耐受性高，用来合成标记的蛋白最合适不过。除了放射性标记氨基酸，Promega还有2种非放标记试剂盒可与不同体系的体外表达试剂盒共用，一个是生物素标记的Lys，可选择显色或者化学发光检测法，灵敏度相当于35S标记Met显影6—12小时，满足一般实验的需要；另外一个是荧光标记的Lys，合成的蛋白可以直接用荧光凝胶扫描仪检测，不用干胶之类的麻烦事。蛮有意思的。

生物通编者一直很关注的另外一个厂家，号称The RNA Company的厂家Ambion也一直有提供体外转录的产品，这家公司的RNAi相关产品也很有特色，最近刚刚被生物产业的大阔佬 ABI 以2.73亿美元高价收购其RNA业务部分——想想我们熟悉的Clontech才卖了6000万，还不到Ambion RNA业务部分售价的零头！Ambion在业界的口碑可见一斑。Ambion这个E.coli体系也是适合单个反应的，ActivePro™ In Vitro Translation Kit特色在于添加了Activity Enhancer,有助于得到更多的活性产物。这个Kit适用于10—120kD的带有T7启动子、核糖体结合位点和终止信号的蛋白表达，产量大约是一个反应（50ul）15—25ug产物，反应时间只要1小时。质粒比片断更稳定一些。国内价格目前要问吉泰，以后可能要问ABI了。

Roche RTS E.coli

罗氏上这个体外表达的项目，目标就非常明确，就是瞅准了后基因组时代的高通量快速研究需要。蛋白质作为实现生命所有功能的最终载体，是所有药物的直接或者间接靶标，同时也可能是未来重要的药物来源。身为药业的巨子，自然非常明白，要从成千上万的候选药物或者靶标中筛选合适的蛋白，这么一个一个片断的体内表达不太适合未来研究的需要，而Rapid Translation System（RTS）正是反应了Roche的期望，也是高通量快速研究所需要的。所以Roche的全部体外表达产品都是可以放大规模和批量反应的，有配套的设计软件，还可以配套专利的仪器和专利的连续交换无细胞（CECF）系统反应。

RTS技术基于3个原理：偶联反应，这个生物通在前面已经解释过了；连续交换无细胞（CECF）系统反应；高产率（HY）生化体系。要得到更多的产物，要么提高翻译效率——这个还是研究的目标之一，要么延长反应时间。延长反应时间需要解决的问题是副产物抑制和底物消耗。连续交换无细胞（CECF）系统，简单说就是用半透膜分隔的反应腔，反应中的副产物通过半透膜渗透到反应腔外，降低抑制效应，而位于反应腔外的供给腔中，底物和能量底物通过半透膜不断渗透到反应腔中，从而解决底物持续供应的问题。高产率（HY）生化体系主要指采用新的能量系统和优化的反应体系，使得表达产物量显著提高。通过CECF延长反应时间和HY系统使得表达量大大增加，最高可以达到6mg/ml.24hour，或者是50mg/10ml反应体系。从下图可以看到，相比体内表达，虽然体外表达产量不占优势，但是背景很少，纯化更容易进行。此外也减少包含体的问题。

我们现在来看看Roche的E.coli系的几个产品，按照反应规模由小到大可分为RTS 100，500和9000，其中RTS 100又分为E.coli HY和E.coli Disulfide。前者术属于小规模蛋白合成，也就是可用常规单管反应的试剂盒，不需仪器或者特殊耗材辅助。由于用到我们提到的HY技术，反应时间可延长到4小时，产物可达20ug/50ul，模版可以是DNA质粒或者片断，方便使用。还可以加入GroE或者DnaK帮助提高可溶性。后者就比较特别，带有二硫键的蛋白不能在还原条件下正确折叠，E.coli Disulfide就是第一个特别为帮助二硫键正确折叠而设计的试剂盒，产量可达80ug/50ul反应。对于有二硫键的蛋白研究这是个好消息，不过可惜，这个试剂盒是专门为高通量反应而设计的，就是说，要配合Roche的专门的仪器和耗材使用。这样成本就高多了，叹气......

RTS 500 E.coli和 RTS 9000都是需要专用仪器的大家伙，什么人要花这样的代价进行这个规模的反应？当然是那些时间就是金钱的研发人员——如果当天小规模筛选出来的一把“潜力股”，24小时后能得到足够进一步研究研究的产物——比如50mg进行分析，比起浪费若干星期筛选摸索表达产物和纯化条件还不一定能得到找到正确的目标，这样的代价就很划算了——早出文章或者早申请专利就是最好的回报。在今后的研究中，由于研究手段不断创新加速，时间的紧迫性会越发明显。RTS 500 E.coli HY 是100的直接放大版，无需另外优化，1ml反应体积24小时可得到5mg产物；RTS 9000 E.coli HY 更是10ml反应体积，产物可达50mg。RTS 500 Disulfide也是同级100的放大版，表达量可达2.5mg/ml。

罗氏公司除了推出体外表达载体、试剂外，还有从小型（配96孔板）、中型（配6孔板）到大型（10mL）表达的配套仪器出售，可以提供一整套的完善服务，包括针对E.coli的序列设计优化软件，也包括为了方便下一步的检测和纯化配有各种标记的线性载体模板提供，包括了：最常用的6×组氨酸标签、红血球凝聚素（HA）标签和麦芽糖结合蛋白（Maltose Binding Protein, MBP）标签。在环状载体中，除了以上三种标签还提供有谷胱甘肽S转移酶（GST）标签供选择。GST本身是一个在解毒过程中起到重要作用的转移酶，它的天然大小为26KD。（生物通作者吴为，谢绝转载）

真核体外表达产品一览待续