体外表达(二)：原理和技术要点[选购宝典]

续前：体外表达（一）：基因组学迈向蛋白质组学的桥梁 

真核vs.原核

    我们前面提到过，体外表达最常用的3类体系是原核的大肠杆菌体系，真核的兔网织红细胞体系和麦胚细胞体系。对于无细胞的体外表达，任何基因，只要序列上满足启动子和核糖体结合位点的要求，就可以用任一体系进行体外合成。3种不同选择，主要是为了满足优化的需要。在决定选择那种体系前，生物通带你首先来看看原核和真核的反应体系有哪些区别。

成份	原核	真核
Ribosomes	70S	80S
mRNA*	SD 序列	5'-7 methyl-GTP cap，3'poly(A)tail，Kozak sequence
Elongator tRNAs, total	prokaryotic	eukaryotic
Initiator tRNA	tRNAf Met **	tRNAiMet
20 individual ARSes	prokaryotic	eukaryotic
Initiation factors	IF’s: 1, 2, 3	eIF’s: 1, 1A, 2, 2A, 2B, 3, 4A, 4B, 4F (4A+4E+4G), 5, 5A, 6
Elongation factors	EF-Tu, EF-Ts, EF-G	eEF1A, eEF1B, eEF2
Termination factors	RF1, RF2, RF3, RRF	eRF1, eRF3
Amino acids	all 20	all 20
ATP and GTP***	+	+
Mg2+	8–15 mM	1–4 mM
K+ and/or NH4+	100–250 mM	ca. 100 mM
Other components	All cell-free systems usually contain sulfhydryl compounds (ME, or DTT,or GSH), protease inhibitors, RNase inhibitors (e.g., RNAsin) and antiseptics(e.g., NaN3).****
Buffer	To maintain pH 7.4–8

 ** 原核（细菌）系统需要含有蛋氨酸（Met）tRNA_f甲酰化亚系统，此亚系统包含有Met-tRNA_f转甲酰酶和甲酰四氢叶酸或者与之同类的物质，例如：甲炔基四氢叶酸或者亚叶酸。

*** 在所有的体外表达体系中，都需要包含一个ATP/GTP再生亚系统（或者PEP+PK，或者CP+CK，或者AcP+AcK或者一个糖分解复合物）。

****　如果蛋白需要形成二硫键，系统需要包含一个GSH/GSSG混合物以保证维持体系的氧化还原势。

原核系统

    原核系统主要利用大肠杆菌的提取物进行表达。近年来对大肠杆菌蛋白合成机制都有十分详细的认识，包括整个合成组分和反应的结构、遗传学、代谢和调节都了解的十分清楚。这使得大肠杆菌的体外表达也随之不断的得到改进。理论上任何遗传信息都可以在大肠杆菌体外表达体系中被翻译成多肽。根据生物通现有的数据，利用大肠杆菌体系进行体外表达，某些蛋白质每小时每个反应（50ul）产物量可高达数百微克，在优化的批量系统中蛋白最终的产量达到1mg/ml也是可能达到的，这一产率还可以通过连续反应器进一步得到提高。

    大肠杆菌提取物系统有一个很大的优势就是它的耐受性，它可以在含有其它不同成份杂质时仍正常的工作。因此人们可以根据需要加入特殊添加剂如蛋白酶抑制剂，分子伴侣，代谢物，非天然氨基酸甚至是少量的变性剂，也可掺入特殊标记的氨基酸获得带标记蛋白质。这样这种体系的弹性就非常大，可以加入许多其它优化成份以提高产率和提高溶解性。例如：修饰过的反应环境可以变成氧化环境以帮助蛋白形成正确的二硫键，然后正确的折叠。加入酶和底物可以完成特定天然的修饰，比如在丝氨酸和苏氨酸残基上进行特定磷酸化修饰。 但是，蛋白的翻译后加工和如何正确折叠仍然是一个问题，特别是利用这一系统合成那些多结构域组成和二硫键的真核蛋白。不过，由于整个体外合成体系仍未解决这个蛋白质翻译后加工的问题，而大肠杆菌的材料来源成本最低，实用性高，表达效率也高，因而很快成为体外表达的最热门的选择。

真核系统

* 兔网织红细胞

    兔网织红细胞可以说是应用得较早的一个体外表达系统。网织红细胞由红细胞分化而来，在体内主要是负责合成大量血红蛋白（90%以上），以及球蛋白。这种未成熟的红细胞本身不带细胞核，但却保留了这种高效翻译各种核酸信息的能力，可减少背景，即使在较低的丰度下也能比较高效地合成产物。根据测定，体外合成外源蛋白的效率接近完整网织红细胞自身合成内源蛋白的效率。此外网织红细胞体系内源的核酸酶很少，有助于长链RNA的稳定（包括有帽子或者没帽子结构的RNA），因而可以合成较大的蛋白。网织红细胞体系是最有希望做到微粒体糖基化的体系。

    兔网织红细胞体系一般有2种，处理过和未处理过的。由于兔网织红细胞虽然没有细胞核，依然有内源球蛋白mRNA，可通过外加钙离子依赖的核酸酶处理除去内源球蛋白mRNA，并通过EDTA处理使核酸酶失活。经过处理的兔网织红细胞体外表达体系背景更低效率更高。未经处理的兔网织红细胞裂解物往往用来研究翻译机制，或者研究球蛋白翻译的抑制物等等。不过，兔网织红细胞来源较其他2个体系成本更高一些。

* 麦芽提取物

    麦芽提取物是不同于网织红细胞裂解物的另一个无细胞体外合成体系。由于内源的mRNA很少，这个系统可用于各种病毒、酵母、高等植物乃至哺乳动物蛋白的合成。当表达产物较难与球蛋白区分（12—15kD）、或者表达产物正好可能是哺乳动物细胞中富含而植物中没有的调控因子一类的蛋白时、或者是不明原因表达不出时，就不妨尝试麦芽提取物体系。不过要记住，这个体系要求RNA有帽子结构才能更好的翻译。如果上述情况又无法给RNA加帽，就只好借助大肠杆菌体系了。此系统广泛用于放射标记多肽和蛋白的合成。合成量不太高，直到最近才通过延长合成时间的方式提高了产率。如果要保持麦芽提取物系统持续数日的合成效率，就必需要保证反应体系不含有任何会破坏核糖体或者其它合成中使用到的蛋白的酶。这种情况下此系统的合成效率可以被不断加强，24小时内最高的合成量可达1mg/ml。麦芽提取物系统和大肠杆菌系统都适合进行高通量的蛋白质组学研究。

    体外表达由于是在无细胞的条件下进行的，缺少蛋白质翻译后加工所需要的细胞器和空间结构，所以其致命的弱点就是：即使是真核体外表达系统，目前依然无法对蛋白进行糖基化和其它天然蛋白必需的高级修饰。如果对体系进行改进，加入微粒体（microsome）理论上可以完成修饰作用。

mRNA的设计要求

    用原核和真核细胞的mRNA转录本有明显的区别。我们知道通常真核mRNA带有转录后加工的5'-7 methyl-GTP cap 和3'poly(A)tail，有助于增加mRNA的稳定性，防止降解。同时5'帽子结构有助于核糖体与mRNA的结合和AUG起始密码的正确识别。对应不同的体外表达系统，我们在设计RNA模版的时候就要区别对待。

    原核生物中，核糖体受一段富含嘌呤的SD序列引导从而识别AUG起始密码。这段位于AUG上游的序列和30S核糖体亚基的16s rRNA一段序列互补，保守区5'-UAAGGAGGUGA-3'，核糖体结合位点RBS和起始密码AUG之间的距离以及碱基的组成对翻译的效率有显著影响，在设计的时候要注意。而真核生物的那段保守序列成为Kozak序列（5'-GCCACCAUGG-3'），要高效翻译，+1G和-3A就很重要。不过如果mRNA没有这段Kozak序列而有一段适当长度5'UTR也能够有效地在无细胞体系中得到翻译。有趣的是，还有数据提示，大肠杆菌的核糖体通常只认得SD序列，而真核比如网织红细胞的核糖体能识别Kozak序列，也能识别SD序列。

The +1 A is the first base of the AUG initiator codon (shaded) responsible for binding of fMet-tRNAfMet. The underline indicates the ribosomal binding site sequence, which is required for efficient translation.

加入启动子和RBS的5'端设计

　

一步法vs.两步法

    如果实验前已经得到足够的mRNA，可以直接进行体外翻译。不过，mRNA不是毛毛雨，不会自己从天上掉下来，一般来说，多数的实验都需要从DNA模版开始。从DNA到蛋白质，按照中心法则，体外表达要分为2个步骤：体外转录和体外翻译。因此，对于真核体外转录体系来说，和RT-PCR一样，体外表达也会出现将两个反应偶联的单管一步法和分开进行的两步法，前者简单而后者效率更高，个中原理也是一样的。

    体外转录是个比较简单高产的步骤，只要DNA模版带有特定的启动子序列，无论是载体还是PCR产物片断都可以高效进行体外转录。通常采用的启动子包括T7,T3 和SP6，因而只要在PCR时两端加入转录启动子序列和前面提到的核糖体结合位点，得到的产物就可以作为体外转录的模版。将转录得到的mRNA模版加入体外翻译裂解液中就可以进行体外表达。两个反应分别进行有利于个别优化反应条件，因而效率也就更高。而偶联2个反应则在操作上比较简单方便。

    不过，上述都是对真核体系而言的，对大肠杆菌体系就不同了。在大肠杆菌中，由于没有细胞核，本来转录和翻译就是同时进行的，一段RNA的3'端还在转录之中，它的5'端可能已经结合了核糖体并开始翻译呢。大肠杆菌的这种机制有助于快速高效表达产物，保持RNA的稳定性。由于翻译后加工的问题暂时都没有得到解决，大肠杆菌体外表达体系的优势就更加明显：体外转录和翻译可以同时进行，不需要对RNA进行帽子修饰反应，和真核没有交叉影响，特别适合高通量反应。还有一点，大肠杆菌系统可以识别带大肠杆菌启动子的基因，如果你的基因已经在lac 或者tac 启动子的载体上，直接反应就可以，不要再加T7重新设计了。但是要注意SD序列是不可少的，设计是要留意。 （待续）

体外表达(三)：应用前景

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