定量PCR Taqman探针试剂之选[选购宝典]

    由于ABI公司在定量PCR领域的领导地位和在推广定量PCR技术上的贡献，Taqman探针可以说是当下荧光定量PCR中使用最多最广的方法之一，特别是在临床疾病检测上。我们大致可将产品分为2大类，一是已经带有标记探针的特定基因的定量PCR试剂盒，最常见的是疾病/病原检测相关的基因，比如EBV病毒、SARS病毒检测试剂盒等等，这种试剂盒只要配合特定的机器按照说明书直接用就好，既省心又可靠。国外著名的公司有Artus，是当年最早推出SARS定量检测试剂盒的公司，国内自然是首推达安基因了，另外被Qiagen收购的深圳匹基公司的定量PCR试剂也颇有名气。这类产品因为已经验证，不需要另外购置试剂，而且比免疫法能更早检测出病原（不用等待机体产生抗原），加上通常成本由病人买单，推广得很快。

    不过科研人员就没那么好运了，科研中需要用到定量PCR检测的目标广泛，不容易找到带有探针的定量检测试剂盒。当然，针对这种现状，几个大公司陆续推出探针库，比如罗氏的UPL通用探针库，就可以通过组合定量检测出人、大小鼠等7个物种的大部分ORF序列，特别适合大型实验室；ABI公司现在可以根据用户的需要提供约十二万种基因表达引物、探针和两百多万种SNP分析的引物探针进行科学研究，据说是源自于世界各地研究人员要求定制探针或者引物后汇总的结果，可惜就是贵，就连美国的实验室教授也大叹“Very expensive, especially for small projects”。

    咱们做实验的，对试剂的要求自然是1.质量可靠 + 2.价格相宜，前者保证实验早出结果，出好结果，不要太多折磨，后者则是要老板承受得起，毕竟没有病人替我们买单。因此自行设计定制标记探针就是多数“第三世界”实验室的选择。Taqman探针法的第二大类产品就是不带探针引物的通用探针法定量检测试剂盒——有酶、Buffer、内参等等配套试剂，模版引物探针自备。大家关心的问题不外是：1.哪一家探针合成标记比较可靠、价格如何？2.哪一家的通用试剂盒比较可靠价格相宜？是不是一定要买试剂盒？对于第一个问题，生物通希望有经验的读者参与我们的网络调查，当搜集到足够样本时我们会将大家的意见更新在本文后面，对于第二个问题，生物通在这里简单介绍一下市面常见的品牌和特色。

[基础用途]就是指基因表达量检测方面而言。

    其中不肖说ABI是个金字招牌，它的优点就在于无论你是要做人类的，小鼠的，大鼠的，果蝇的，线虫的还是植物拟南芥的，连序列都不用呈递，只要把基因名字说出来就行了，除了基因序列全面完整之外，ABI的试剂的各方面的条件也是摸索优化好了的，基本上只要不出大的问题——比如说仪器出错，样品制备得太差——ABI的这些试剂都可以得到不错的结果。但是缺点就是贵（200个反应4500），以及时间周期比较长，不过如果你希望能发到高点数的文章，这些时间金钱可能还是省不了的。

    在ABI的这些试剂盒中一般都包括AmpliTaq或者AmpErase金牌酶（具体见定量PCR:“酶”头一蹙，计上心来 Qiagen vs.ABI(1)），缓冲液，对照等，另外如果是RT-PCR试剂盒还会有逆转录酶——这里有个一步法和两步法的区别，一般而言两步法较灵活，一次cDNA反应可以进行多次PCR反应，而一步法就相对简单快速。ABI有个通用型的一步法试剂盒（Universal PCR Master Mix），这个试剂盒其实也就是Core Reagents试剂盒的成份，但是已经预混合起来的，并且在此基础上加入了一些额外的成份帮助完成简单高效的Taqman探针定量PCR反应，反响不错，甚至对于一些“刻薄”的G/C富集的模板也得到了相当不错的结果。

    Qiagen的Quantitect Probe PCR/RT-PCR也是一个基于探针的定量PCR通用试剂盒。酶自然也是选择严格的Hotstart酶，试剂盒同时提供荧光内参、dNTP和优化缓冲液，价格要30元/次反应（50ul，如果你把反应体积减少到25ul，就可以将成本再减半），如果你是生物通新闻栏目的幸运读者能拿到最近生物通送出的优惠券，那几乎可以又便宜一半。如果你要做Multiplex多重PCR，或者同管内检测目的基因和管家基因，那么你还是不要再幻想自己配试剂了，QuantiTect Multiplex PCR应该是更好的选择。这个每管最多可做4个模版、检测灵敏度低至10个拷贝也能检测出来、已经优化稳定可靠的试剂每次成本40多元，优惠下来22左右，如果将反应体积减半还可以便宜到10元多点儿。比起自己慢慢摸索要快得多。可以选择有ROX内参荧光或者无ROX的试剂盒（如果你的机器不是ABI，不要ROX干扰也罢），价格是一样的。

    Stratagene的Brilliant系列则是以Core Reagent和MasterMix的形式提供（其实后者就是预混好的试剂，方便一些；前者就是各自分开的试剂，要自己混合，不过可以自己调整份量）。这一系列产品不单可用于Taqman探针法，还可以Scorpions，Amplifluor、杂交双探针法和分子信标等等，实在是非常通用的选择，同样都是严格热启动Taq酶，优化的试剂，可靠的公司信誉，还可以选择有dUTP + UNG的Plus配方。Brilliant的RT定量系列还分有单管和两步法可供选择。价格也和Qiagen不相上下，同样是50ul一次的反应原价是30多元，6月底前特价6折，如果反应体系25ul成本就降到9块钱左右。Brilliant的MultiPlex比Qiagen的便宜，也可以做4个target，原价是30块左右一次，生物通上6月特价是15块左右，反应体积减半价格就去到8块左右啦，价格直逼国产试剂。如果你是Stratagene的粉丝，就不要错过这个机会。

    说实话，罗氏的杂交探针确实比Taqman更可靠，只是一直没有得到很好的推广。Roche主推杂交探针，但也没有忽略Taqman的市场，LightCycler TaqMan Master则是配合其LightCycler^® 2.0 System Instruments推出的一套试剂盒(也可以在其它定量PCR仪器上使用，比如ABI的7500），LightCycler本身就以速度著称，而这个试剂盒以玻璃毛细管的形式提供，配合了热启动酶和优化Buffer，进一步提升了实验的速度，这两者的结合应该是目前所知定量PCR（或者RT-PCR）反应的“速度之王”了吧。就是价格比较吓人。

    同类的产品还有不少，由于原理都差不多，就不一一列举。

[拓展用途]Taqman不仅在深度上得到了充分应用，而且逐渐也扩增了其广度。这一方面体现的特别显著的就是ABI的试剂了。

    ABI号称有数以千记的Taqman试剂盒，除了上面提到的用于一般基因表达量分析的PCR或RT-PCR的试剂盒外，还有SNP分型，低密度表达谱试剂盒，miRNA，药物代谢等。其中TaqMan® Low Density Arrays主要用于配合芯片使用，即在芯片检测之后进行的进一步鉴定，其特点就是方便和节省试剂，而用于SNP分型的则包括Custom TaqMan SNP Genotyping Assays、TaqMan Drug Metabolism Genotyping Assays、TaqMan Pre-Developed Assay Reagents for Allelic Discrimination和TaqMan SNP Genotyping Assays四种，其中可以用于基础和临床研究的药物代谢基因分型试剂盒是目前唯一的一种可以用于药物筛选的SNP分析Taqman试剂盒，主要原理是利用涵盖了220个编码药物代谢的酶（DMEs）和相关转运蛋白的基因的2000多个位点，融合Taqman等位基因分辨技术进行多态性分析（见定量PCR Taqman探针的应用[高级篇]）。

    此外还有miRNA表达试剂盒，这一款ABI去年推出的试剂盒在其未商品化之前其实就已经进入实验室了，去年欧洲协会的人类遗传学年会就有实验室展示了利用这个产品获得的实验结果，其最重要的特征就是可以将成熟miRNA和前体区分开来，获得准确的分析结果，目前共有两款产品可供选择：Human Panel – Early Access Kit和ABM 000008 hsa-miR-16。

    此外，除了Taqman探针法，罗氏的杂交探针是科研上更为严谨的选择，而试剂的选择自然以罗氏为主。Stratagene的Brilliant系列不单可以用于杂交探针，还可以用于分子信标、Scorpions，Amplifluor等其他的标记方法，如果你打算采用Taqman以外的方法，Brilliant是不错的选择。
（生物通：张迪 薇安）