定量PCR:“酶”头一蹙,计上心来 Qiagen vs.ABI(1)[选购宝典]

【字体: 时间:2006年05月18日 来源:生物通

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    (生物通技术专题之定量PCR篇) 要想解决定量PCR反应中SYBR荧光染料的非特异性问题,其实和解决常规PCR的非特异扩增是一样的考虑方向。引物设计绝对是首选的考虑对象,然后就是DNA扩增酶,因为DNA扩增酶是限制PCR扩增反应的一大关键要素,而且我们也确实积累了不少经验。

    做完PCR后电泳检测经常能看到一些非特异扩增的条带,虽然通过电泳分析可以区分并分离出目的条带,但是对于荧光染料法检测实时定量PCR分析来说,荧光染料并不能区别目的产物和非特异产物,这些非特异扩增产物就成为无法校正的可怕误差,而且重复性不高。这些讨厌的副产物是怎么来的、如何才能避免呢?前辈的经验之一是:Taq酶虽然最佳延伸温度是在72℃,然而从室温到高温上限这个广阔的范围内仍有非常强大的活性——这就意味着在反应建立的初期,一旦PCR反应体系中混合了酶、引物、模板等全部反应元件后,“生机勃勃的”Taq酶就已经“开工干活”了——虽然这个升温过程中模版可能有二级结构没有完全解链,或者还存在引物二聚体、错配,可我们勤劳的Taq酶并不管这些3721,继续高效率的“瞎忙活”——因而也就可能产生一些不完整的产物或者非特异的产物,“混入”模板队伍中,在随后的扩增中一道被扩增,成为讨厌的非特异产物。因此,首先是好的引物设计,其次,热启动(hot start)就是提高PCR 特异性最重要的方法之一了。土办法是将酶加到管壁上,等到94度再混合或者94度后才加酶——可是样品数多就来不及了吧。商业化的热启动Taq酶就应运而生了,比如较早期用WaxBeads蜡珠包裹酶待温度升高到50度左右腊质熔化释放Taq酶;加入Taq酶抗体待温度升高70度左右抗体失活释放Taq酶等等,但是这些方法都比不上最严谨的方法——化学修饰Taq酶—— 一种需要加热到95度以上才能恢复活性的Taq酶。

一、Qiagen的酶学策略+预证引物设计

QuantiTect Primer Assays

    引物设计,特别是SYBR Green方法做real-time RT-PCR的引物设计是比较考功夫的——引物的专一性是结果特异性的最重要保障,当需要选择较小的片断而非全长基因来做定量时,自行设计引物如何保证专一性和特异性有时不免令人头疼。QuantiTect Primer Assays是Qiagen特别为SYBR Green方法做real-time RT-PCR 而设计的引物对,涵盖人类、大鼠、小鼠等7个物种基因组上13万多个基因,这些已经反复优化、经过预证的引物对能100%保证提供高度特异和灵敏的结果,最大的好处就是你可以节约很多时间,不必再为自行设计引物而头疼,避免由于引物设计不当、或引物合成/纯化问题而得不到理想的结果、以及避免由此而导致的精力、时间和实验材料的浪费——有的时候时间就是金钱,由于总是得不到理想的结果而不得不反反复复地重复实验,这种苦头大家或多或少都有体会吧?QuantiTect Primer Assays经过Qiagen专家反复验证,保证不会出现引物二聚体,能保证得到的结果在相当宽范围内的保持良好的线性关系,得到比探针法更灵敏的结果,那就不需要考虑更加昂贵的荧光探针法了,所以从某个角度来说,购买预证引物能省时省事,也能省钱的。用来快速做基因表达分析、基因沉默验证或者是DNA芯片结果的验证非常合适。当然,Qiagen预证引物对的合成质量、纯度你都可以绝对信赖,如果能打个较大的折扣,那么近千元一对的预证引物(足够做200次50ul反应,或者500次20ul反应)折半下来就不那么吓人了,毕竟是专家预证过的引物啊。到底是省事省时还是省钱?如何权衡得失还要自己考虑。现在2位生物通的幸运读者将可获赠Qiagen公司提供的QuantiTect Primer Assay引物各一对,需要申请的读者请回答调查问卷,并自行到Qiagen的GeneGlobe portal上检索你需要的目的基因引物编号。geneglobe数据库提供方便的检索界面和详细的基因特异性产品的信息,包括转录本的信息和图示,引物扩增区段的位置和扩增区段的长度。另外,针对于同一基因的探针和siRNA也可以在同一个数据库里面找到。值得注意的是,这个Primer的设计针对于mRNA检测,不会检测到gDNA,所以即便样本没有经过DNase处理也没有问题。当然,如果是单外显子基因,或者有假基因存在的话,检测到gDNA是不可能通过primer的设计来避免的。

Superior Sensitivity in Real-Time RT-PCR

人类淋巴细胞(10 ng)IL1RN和IL12A分别用QuantiTect Primer Assays+QuantiTect SYBR Green PCR Kit, 或者Supplier AII的荧光探针检测

Reproducible Real-Time RT-PCR over a Wide Linear Range

 

Qiagen的酶学策略(未完待续)

“酶”头一蹙,计上心来 Qiagen vs.ABI(II) 

“酶”头一蹙,计上心来 Qiagen VS ABI(III)

  ·定量PCR技术报告之三:如何选择荧光定量检测技术(I)之SYBR Green I系列
  ·定量PCR新技术报告之二:更准确、更安全的GeneXpert定量PCR一体机
  ·定量PCR新技术报告之一:UPL

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