His Tag蛋白纯化方法之选择全攻略(1) -His|Taq|组氨酸|融合蛋白|纯化|Ni|NTA|Qiagen-生物通

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生物通技术专题之HisTag蛋白纯化篇：用基因工程的方法来表达蛋白质，必须经过纯化才能实现最终目的。相比核酸纯化来说，不同的蛋白质特性千差万别，纯化条件很难摸索，想找一种通用的纯化方法一直是个难题。将目的蛋白和一个亲和纯化短标签进行融合表达，通过亲和纯化Tag蛋白来纯化目的蛋白，是我们常用的间接手段。

用于融合表达的亲和纯化蛋白标签，首先个子越小越好，这样不会对目标蛋白的构象、大小和特性产生显著影响，方便直接对融合蛋白进行下游操作；以前常用的融合表达亲和标签GST(谷胱甘肽转移酶)个子就比较大，在纯化后需要先切除标签后才能进行下一步的检测分析。其二生理条件下带电越少越好：需要借助融合表达纯化的许多蛋白通常在生理溶液pH下进行分析研究或者复性，融合标签带电少，对蛋白质的表达、分泌、折叠、构象形成等影响小，比较容易得到和天然蛋白相似的产物。第三融合标签的免疫原性越少越好，融合产物不必除去标签可直接作为抗原免疫

横看竖看，6xHis Tag都是比较理想的，6个组氨酸个子小，pH8是不带电，免疫原性差，利用优质的带镍离子的纯化填料进行亲和纯化，目标蛋白纯度高，方法简单方便，成本低，已得到国内外研究人员的广泛应用。想当年刚进实验室时,表达6xHis的HisTag还算“前卫”技术（表达纯化一个带有HisTag的“有重要意义和光辉前景的”蛋白就可以混个硕士毕业），如今早成主流了。

我们生物通技术专题早前的表达系统专题中已经介绍过多种带有His-Tag的表达载体，表达之后自然需要考虑如何纯化，市面上纯化HisTag的产品多种多样，应该如何选择呢？目前市面上主流产品都是利用His.Tag序列相邻组氨酸和固定化金属镍离子的亲和力来进行纯化。金属镍离子被螯合到固相支持物共价结合的反应性基团上，当融合蛋白溶液流经亲和纯化介质时，融合蛋白被特异亲和吸附，杂质被洗掉后再洗脱目标蛋白。最常用的螯合物包括氮川乙酸（NTA）和亚氨二乙酸（IDA），它们分别具有四个和三个与金属离子相互作用的位点。生物通在这里介绍几个市面口碑较好的产品和方法,包括常见的HisTag纯化高端品牌：Qiagen，GE，Novagen等。

Qiagen产品的2大特点是4价螯合的Ni-NTA（nickel-nitrilotriacetic acid）；以及种类齐全。Qiagen专利的4价螯合的Ni-NTA纯化填料，由于镍离子通过4价键螯合在纯化树脂(填料)上，比3价的Ni-IDA要稳固且不容易脱落，且NTA与还原二硫键的beta- 巯基乙醇相容；而存在其它螯合或还原成分时， IDA树脂的金属镍离子容易脱落可导致纯化结果不甚理想。因此Ni-NTA实际应用中的蛋白纯化效率和得率较高。因于这种稳固性，Qiagen的Ni-NTA纯化介质不单可用于纯化带HisTag的表达产物，还可以作为固定介质用于研究蛋白质间的相互作用或者蛋白质和核酸间的相互作用、研究蛋白质受体和配基的相互作用、甚至用于纯化与融合蛋白相互作用的其他蛋白或者核酸。

Qiagen的Ni-NTA纯化介质产品种类最为齐全，设计非常细心体贴，不过花太多，就容易眼花缭乱，我们说花多眼乱。Qiagen的目录里是根据纯化实验的规模分为大、中、小规模，具体又分为高通量和手工纯化等区别，对于急着寻找自己需要产品的人来说自然便捷；不过作为生物通的技术专题文章，我个人来说更愿意按照介质种类的不同来介绍，因为理解了材料的区别，一切都清晰明了，就能更深入了解不同品牌、不同类型、不同产品的特色。

Qiagen的Ni-NTA系列产品可分为4类：Ni-NTA琼脂糖、Ni-NTA Superflow、Ni-NTA磁珠、Ni-NTA 离心柱（Spin Column）。

昔年做销售时Ni-NTA琼脂糖是最多人买，因为价格相对便宜，质需要将澄清的裂解液（或者离心或者过滤）直接上柱，洗脱，就可以一步纯化出带有His Tag的融合蛋白。这个目标蛋白载量10mg/ml左右，介质是Sepharose CL-6B，最大流速是每分钟1毫升，可耐受的最大柱内压2.8psi(0.2bar)，适合自己装重力流常压液相层析柱，可以根据每次实验目标蛋白的含量来调整纯化填料的使用量和装柱的长度，比较灵活避免浪费。不过但凡客户问到，我都愿意推荐Ni-NTA Superflow。Ni-NTA Superflow介质是高度交联的琼脂糖凝胶，同样只需一步就从澄清的细菌裂解物中纯化得到带有HisTag的融合蛋白，可以耐受天然或者变性条件，包括8M尿素，或者6M盐酸胍，还可以耐受20mM的巯基乙醇或者10mM的DTT等还原剂。除此之外，Ni-NTA Superflow可以耐受更高的压力（140psi,10bar）,流速更快（最大可达到20ml/min），可以上快速蛋白液相色谱（FPLC），载量达到20mg/ml。我们都知道做蛋白纯化是非常考耐性的工作，如果是自己装稍微长些的重力流柱，整个纯化过程无比漫长。流出的速度过快不单影响结果，还会损害纯化柱子。选择速度、耐性和强度都更加出色的Ni-NTA Superflow自然更好些。两种填料都可以耐受很宽的pH范围（pH3-12），如果处理时间在2 小时内，都可以耐受pH2-14而保持稳定。

纯化填料虽然在使用上比较灵活节约，可以根据实验中目标蛋白的大概含量来调整装柱的填料多少，不过装柱始终是个麻烦事，速度慢不说，有气泡、有裂缝、干柱等等意外就会前功尽弃，每次装柱的差异都有可能影响结果的重复性。散装填料更适合那些专门做纯化或者蛋白纯化经验非常丰富的高手。Qiagen很快意识到，对于多数实验人员来说，更重要的是利用先进的实验工具或者方法快速得到实验结果，而不是反复练习实验技能。于是，Ni-NTA Superflow预装柱上市了。这种预装1ml或者5ml的柱子保留了填料的大部分优点，省掉了自装柱子的麻烦，最重要的是令实验能得到更好的重复性。预装柱既可以适配于多种型号的快速蛋白液相色谱仪或者蛋白纯化工作站，也可以利用注射器进行手工操作。优化的Ni-NTA Superflow预装柱的再生非常方便，仅需要用NaOH流过处理30分钟即可再生使用。Ni离子结合相当牢固，就算多次再生后，偶然发现纯化效果下降需要用镍离子重新螯合填料，其操作也相当简便。目前Qiagen正在为这个预装柱搞活动，不单有特价，还可以申请免费试用装，亲自尝试一下新技术带来的实验快感，如果共享试用信息还有机会获得免费的iPod呢！详细信息请查看http://www.ebiotrade.com/custom/QIAGEN/070406/index.htm

除了Ni-NTA琼脂糖、Ni-NTA Superflow，另外一个好用的是Ni-NTA 离心柱（Spin Column）。这个Ni-NTA 离心柱（Spin Column）和核酸纯化的小离心柱很象，不用慢慢等它一滴一滴流，也不要特殊的豪华仪器，只要离心机就够了，真的非常方便。每个柱子载量是150微克，特别适合研究的初期阶段时小量纯化做快速的检测分析。毕竟，要做到摸条件大规模纯化蛋白的，还远着呢，花那工夫不如早点出结果哦。