全球各实验室如何进行RNAi实验?

【字体: 时间:2007年07月25日 来源:生物通

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  对于那些之前在研究基因功能方面受到挫折的研究人员而言,体内RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术的出现就好像是救兵一般,令人欣喜。理论上体内RNAi能进行更加细致的敲除,从而研究人员能获得时间和空间调控的基因敲除效果。

  


    对于那些之前只能用基因敲除小鼠来研究基因功能而备受挫折的研究人员而言,体内RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术的出现就好像是救兵一般,令人欣喜。基因敲除方法欠缺灵活性而受到很多限制,比如不可逆、是基因组整体敲除而非局部,不能用于关键基因,操作周期长等等;而相反,体内RNA干扰使研究人员在时间和空间上灵活调控基因敲除效果成为可能。

    但是这并不意味着体内RNAi是一件容易完成的实验,实际上体内RNAi最令人困扰的难题是----递送---如何有效将siRNA传递到细胞内,即使在培养细胞中也是一样。就像来自Integrated DNA Technologies公司的Mark Behlke说的一样,“在体内,问题其实是一样的,不同的只是要更加困难十倍”。研究人员需要将siRNA导向指定的靶器官和靶细胞,有效的转染细胞,并且还要解决好毒性和脱靶的问题。

    值得留意的是也有一些小技巧能解决一些问题,比如说,对于人工合成的siRNAs,可以利用一些阳离子脂质体来中和RNA的负电荷,从而使得这些RNA更容易通过细胞膜,或者进行化学修饰,保护RNA不受到核酸酶,免疫反应、其它脱靶效应的影响。还有就是合成27mers的RNA,其被吸收的效率更高些。

    近期一些研究表明,通过病毒载体传送短发夹结构编码siRNA也许是一种更为有效的敲除方法。但shRNA表达水平各不相同,并且有些长效基因沉默(例如整合到染色体上)不适合一些实验应用的需要。新一代的传送方法,比如纳米粒子,PEG修饰脂质体(pegylated liposomes)初露曙光。可惜这些方法通常难以制备,除非你有在化学或者制药学方面的合作伙伴,否则“你只能从资料上查到它们,但是就是搞不到。”

    对于第一次进行体内RNAi实验的研究人员来说,这些都是问题,ABI的Steven Suchyta说,“并没有什么捷径可以让你轻松过关,可以借鉴的只是经验”,以下就是一些经验之谈。

肿瘤敲除
实验人:德国埃朗根大学(University of Erlangen)肝病学与肿瘤学教授Matthias Ocker
项目:敲除抗细胞凋亡基因Bcl-2,以及其它与胰腺癌,肝癌相关基因
问题:将siRNA传递到全身肿瘤
方法:
Ocker的实验室将培养的肿瘤细胞作为异种移植注射到小鼠中,待这些肿瘤生长之后,研究人员以低剂量(体重100 mg/kg),低体积(每天100ml),通过腹腔注射,将溶于生理盐水的未修饰siRNA注入小鼠,对靶基因进行系统敲除。
Ocker表示,“我们也发现使用的载体对于敲除效率十分重要,生理盐水或者PBS都不错,但无菌水效果却不好。”
优点:全身性的siRNA传输对原位癌和转移癌已经扩散的癌症来说是有意义的。
缺点:没有运输载体靶向特异性的细胞类型,降低了效率。
底线:
Ocker表示,“针对癌症,你需要一种系统性的方法”,“目前存在个大问题--我们现在缺乏一种能专门帮助胰腺癌细胞特异性吸收(siRNA)的运输载体或者靶向工具”。要解决这个问题需要一段时间,来自哈佛医学院的Judy Lieberman最近发现融合有抗体片段的融合蛋白能识别特异性受体,从而可以靶向乳腺癌细胞。

 

特异靶向
实验人:德州大学医学院麻醉学副教授Helen Lee Hellmich
项目:研究大鼠海马区因脑外伤而表达上调的神经元一氧化氮合成酶及其它基因的治疗前景
问题:如何在正确的时间靶向正确的器官
方法:Hellmich等人利用芯片技术鉴别出在受伤后几天(而不是几个小时)增加表达的基因,并以此作为瞬时RNA干扰的靶标。Hellmich最早将siRNA克隆进了一个腺病毒载体--能持续表达4个星期,比起其它整合型病毒载体时间更短。为了向临床靠拢,Hellmich转向用阳离子脂质体包裹siRNA,立体定位注射(stereotactic injection)到海马CA3区域,在几个小时到几天的时间内,siRNAs获得了更精确的瞬时传递。由于Hellmich在RNAi方面缺少经验,因此他采用了商业产品来完成。“我从厂家购买了这个产品,祈祷获得最好的结果。”
优点:
比较于基因敲除小鼠,siRNA更容易推测得到的表型
公司能提供一些现成的产品
缺点:
通过手术定向给药困难
对于不同的基因,过程需要重新优化
底线:
鞘内注射(Intrathecal injection),这是一种靶向大脑的常见方法,但对于靶向大脑某些特定区域并不合适。Hellmich的方法能得到体内50%-60%的基因沉默,她说,“这也许足够了,如果一个基因对于生存而言是必需的,那么你只要敲除那些过量表达的部分就可以了”。终极而言,这个领域需要更好的递送系统,现有的产品“也许并不是最优的,但五年来,我得说至少是可以用的。”

(生物通:张迪)

下篇: RNAi小诀窍

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