RNAi小诀窍

RNAi小诀窍

　　

上篇：全球各实验室如何进行RNAi实验？

病毒入侵（Viral Invaders）
实验人：南阿拉巴马州立大学微生物学和免疫学教授Sailen Barik

项目：敲除编码呼吸融合病毒 (Respiratory Syncytial Virus，RSV) 功能亚基的基因，阻断病毒在小鼠体内感染

问题：将脂质体方法传递与化学修饰siRNA和27bp的siRNA结合的情况下，操作方法通用

方法：通过鼻内给药的方法将阳离子脂质体和siRNAs复合物递送到目标。Barik说：“对于呼吸病毒来说，这是最好的途径，因为病毒基本上停留在肺中，不会扩散到其他部位。”未经修饰的siRNA也是有效的，但效率低。于是研究人员对其进行化学修饰，但困难是如何确定对siRNA修饰的位点，因为经过修饰后，原本有效的试剂有时会无效。他们还尝试了27mer链，Barik说结果没有明显改善。

优势：对于肺部研究，存在一个有效的传递途径

缺点：某些参数修改意味着需要重新优化操作流程

底线：要将不同的方法整合起来应用，需要付出很多劳动。已发表的操作方法不一定有什么帮助。“我认为现在应该将不同的化学修饰与27mer结合起来，检测在体内的效果，”Barik说，化学修饰通常有效，“但你得指出在你的系统中哪个位置修饰才有用。”更何况，化学修饰过的siRNA在使用递送试剂时，情况完全不同。"

载体敲除（Vector Knockdown）
实验人：斯坦福大学研究生Daniel Paskowitz

项目：敲除成体大鼠视网膜中的基因，研究视网膜病变

问题：维持遗传表达的稳定性

途径：Paskowitz通过注射的方式，利用腺相关病毒（adeno-associated viral ，AAV）载体将shRNA递送到视网膜中。Paskowitz说DNA能够以一种比siRNA更稳定的方式被递送到细胞内。尽管大多数AAV载体的表达需要2－4周，但利用一种经多个实验室改进的强启动子将表达时间缩短到几天内。

优点：
shRNA载体在“定位导向”上比siRNA更灵活
研究人员可以同一种已经优化的病毒载体输送方法来输送不同的siRNA
一些病毒亚型有细胞特异性，可用于定位导向

缺点：
敲除效果好坏不一
克隆病毒载体比直接用siRNA需要的时间长
许多病毒载体需要较长时间开启表达

vivian(生物通) 15:59:34
载体敲除（Vector Knockdown）
实验人：斯坦福大学研究生Daniel Paskowitz

项目：敲除成体大鼠视网膜中的基因，研究视网膜病变

问题：维持遗传表达的稳定性

途径：Paskowitz通过注射的方式，利用腺相关病毒（adeno-associated viral ，AAV）载体将shRNA递送到视网膜中。Paskowitz说DNA能够以一种比siRNA更稳定的方式被递送到细胞内。尽管大多数AAV载体的表达需要2－4周，但利用一种经多个实验室改进的强启动子将表达时间缩短到几天内。

优点：
shRNA载体在“定位导向”上比siRNA更灵活
研究人员可以同一种已经优化的病毒载体输送方法来输送不同的siRNA
一些病毒亚型有细胞特异性，可用于定位导向

缺点：
敲除效果好坏不一
克隆病毒载体比直接用siRNA需要的时间长
许多病毒载体需要较长时间开启表达

底线：
“不是所有的shRNA效果都一样，”Paskowitz说，“预测哪个有效、哪个无效，仍然不可能。”不同病毒有不同的表达时长，但在视网膜中，AAV递送的基因基本上是持续表达的。虽然Paskowitz实验中使用的器官递送siRNA并不困难，但他认为，病毒载体传递比大多数siRNA方法灵活。某些AAV特异感染感光细胞，其它的特异感染色素细胞，理论上，可以利用不同类型病毒靶向截然不同的细胞类型。

 

全面敲除取代（Full-on Knockout Replacement）
实验人：哈佛大学医学院非肥胖型糖尿病小鼠中心管理员John Stockton

项目：构建可遗传的基因敲除，如与I型糖尿病有关的CELA4

问题：多个病毒整合位点导致表达水平差异

方法：Stockton与其同事通过显微注射，利用慢病毒载体将shRNA递送到小鼠胚胎，然后将这些胚胎移植到预先怀孕的雌鼠体内。雌鼠所产子代体内靶基因被部分敲除。“与普通转基因过程相似，”Stockton说，“但这里，因为出现不同的病毒整合插入位点，表达水平更加有差异。”

优点：可遗传的、永久的基因抑制效果；比构建基因敲除小鼠快3倍；适用范围广，除小鼠外还可用于鸟、鱼、大鼠、家畜

缺点：不完全敲除；表达率不稳定；慢病毒的生物安全等级为2，操作要小心

底线：编码RNAi的病毒载体能快速实现类似传统基因敲除的功能。但目前只能部份阻断靶基因的功能。不管怎么说，该技术不仅更快而且更有效。运气好的一天就可以100%成功，一般的成功率也接近30%，比核内注射（pronuclear injection）的效率高，Stockton认为，第一代小鼠体内有10％－40％的细胞能表达shRNA，这种差异性在其子代就会稳定下来。