优化蛋白相互作用实验（二）[创新技巧]

利用一些方法和手段能避免蛋白相互作用研究方法的短处，利用其长处，这里提及了一些著名实验室采用的方法，以及一些技术上创新的市场产品，希望能有助于您的实验研究。

优化蛋白相互作用实验（一）

3.如何进行信号通路蛋白作用的实验研究？

如何高效、准确地获取生物体内分子间相互作用的信息，是阐明信号转导机制的关键和基础，其中尤其重要的是蛋白之间的相互作用，但是要进行信号通路中蛋白的相互作用研究存在一些难题，比如信号通路中常常包含有膜蛋白和翻译后修饰的蛋白，这两者都不能用Y2H分析，而coIP/MS又很难检测到低丰度的蛋白。

多伦多Mount Sinai医院Samuel Lunenfeld研究中心的Jeff Wrana资深研究员在他的一项研究项目——“绘制哺乳动物细胞信号系统中蛋白相互作用动力学图谱”（研究成果公布在《Science》杂志上（Science, 307:1621-5, 2005））中提出了一种折中的办法：LUMIER (luminescence-based mammalian interactome mapping), 这是一种研究哺乳动物蛋白之间相互作用的自动高通量方法，其中也包含了Y2H和coIP/MS的高通量元素。这种方法中的interactome指的是细胞分子之间的整个分子相互作用，类似于基因组，蛋白质组的英文。

Wrana博士解释道，“质谱分析方法中，是用诱饵蛋白进行IP，然后寻找相关的蛋白，而LUMIER则相反，它完成的是一个不同的问题：A蛋白是否与B蛋白相互作用，而且作用方式是不是相互有关联的？”

将诱饵蛋白（bait）连接上Renilla荧光素酶（Renilla luciferase），而“猎物”或靶蛋白（prey or target protein）——也可以是整个文库——则与一般表位（generic epitope）进行标记。在哺乳动物细胞中同时表达这两个结构，然后裂解细胞，用激活剂（比如TGF-beta）刺激，这样通过anti-epitope（具有荧光素酶活性）的免疫沉淀就可以检测出蛋白相互作用。

LUMIER可以用于哺乳动物细胞，能检测到生长因子依赖性蛋白相互作用，由于LUMIER不需要功能性的readout，因此可以“更加不局限的检测相互作用”，Wrana说，不同于Y2H，“细胞中任何地方都有可能出现相互作用，这种方法对于分析膜蛋白，表达量低的蛋白，或者比较大，多聚体的蛋白十分有效。”

如果想进行这方面的实验，可以向Wrana实验室询要LUMIER载体，另外其中提及的一个重要的报告基因——Renilla荧光素酶是海洋生物Renilla reni-formis等中分离得到的生物荧光素，是一种具有绿色荧光的黄色染料，分子式为C20H12O5，不溶于水、苯和氯仿，溶于冰醋酸等。

比较于细菌荧光素酶和萤火虫荧光素酶，Renilla荧光素酶可以催化肠腔素(coelenterazine)氧化，产物可透过生物膜，可能是最适用于活细胞的报告分子。

在荧光素酶产品方面做的颇为出色的Promega公司有一款Renilla荧光素酶分析系统——这也是唯一的海肾荧光素酶检测试剂盒，这个系统可方便地替代萤火虫报告基因系统，得到可靠的、线性范围超过7个数量级酶浓度的结果。

而且与其它试剂相比，获得专利的海肾荧光素酶检测系统组分配方显著降低了腔肠素(coelenterazine) 的自发荧光影响，比已发表的方法灵敏度高几个数量级，这些都是对于信号通路研究而言是求之不得的优点。

这个试剂盒包括海肾裂解液，海肾荧光素酶检测缓冲液和海肾荧光素酶检测底物，大约为523美元（1000 assays）。

 

4.如何完成膜蛋白相互作用实验？

不消说，做过Y2H实验的人都知道，酵母双杂的一个硬伤就是膜蛋白的分析研究，但是对于具有很多重要生物学功能的细胞膜来说，其功能大多数是由膜蛋白执行的。

为了解决这个难题，加拿大多伦多大学Donnelly细胞和生物分子研究中心的Igor Stagljar教授提出了一种称为膜酵母双杂交（membrane yeast twohybrid，MY TH，生物通译）的方法，并将这种方法应用到了他的研究中，完成了“完整膜蛋白的相互作用蛋白质组学研究”（PNAS 94:5187-92. 1998）。

Stagljar教授在进行现存的生化及遗传学方法分析时，发现这些方法或者不能配合酵母双杂——Y2H不能用于膜蛋白，或者会破坏蛋白复合体——不适用于coIP/MS，因此不得不另想它法。

他发展得到的MY TH方法吸取了Y2H的优点：简便的遗传学操作和适合高通量分析，适用于细胞质中的完整的膜蛋白研究，以及出现在任何细胞位置的膜（比如内质网，高尔基体，和线粒体）结构上的相互作用。Stagljar认为，“这是至今为止，唯一的一种证明能用于研究全长，完整膜蛋白相互作用的筛选系统。”

MYTH原理十分巧妙，应用到了分离泛素系统（split-ubiquitin）：将诱饵(bait)即一个完整的膜蛋白，融合到泛素的C末端（这个泛素与一个转录激活因子相连），而“猎物”或靶蛋白（prey or target protein）则融合在泛素的另一半上，bait和prey的相互作用就会让重新构成泛素，从而被一种特异性的蛋白酶（泛素专一性蛋白酶，UBPs）剪切，释放出转录激活因子，这个转录激活因此转移到细胞核上，开启报告基因的表达。

这样双杂交过程就不一定要在细胞核内完成，便于针对那些需要定位到膜上之后才能表现正常生物功能的蛋白质。不过这一方法对于研究哺乳动物蛋白可能比较困难，因为靶标常常需要翻译后修饰，这在酵母中不能实现。

Stagljar的MY TH技术已由瑞士的DualSystems Biotech公司商品化了，这家公司成立于2000年，是从瑞士苏黎世大学独立出来具有自主产权的生物公司。公司的主要业务领域集中在蛋白组学领域产品，包括通过酵母系统进行蛋白质间相互作用研究的产品和服务，cDNA文库构建试剂和服务，在酵母中或E. Coli中进行重组蛋白的制备和纯化，以及一系列相关的试剂和抗体。

这个试剂盒（The DUAL membrane kit 3）既可以用于全长完整的膜蛋白的筛选，也可以进行cDNA文库识别与目的蛋白有相互作用的新蛋白。其特点包括：

  ·可以进行体内全长完整蛋白相互作用分析；
  ·检测到的蛋白相互作用是在细胞膜生理条件下获得的；
  ·通过筛选cDNA文库可以找到新的相互关系；
  ·利用sfi I技术可以简便的完成全长cDNA插入的亚克隆（sfi I为稀有酶切位点）；
  ·报告菌株NMY51减少了假阳性的出现。

这个NMY51菌株是DualSystems Biotech开发的一种改良的酵母菌株，有三个独立的报告基因：HIS3, ADE2和 lacZ，第一步通过营养缺陷型报告基因（HIS3, ADE2）进行选择性生长筛选，进一步通过LacZ报告基因进行β-半乳糖分析显色的定量或半定量筛选。由于含有三个独立的报告基因，因此受不同启动子的调控，降低假阳性几率。

这个试剂盒目前价格为3900美元，有兴趣的可以询问一下达科为，目前达科为是其在中国的独家代理商。

 

Tips：

1.至少采用两种互补的方法

最好能通过一些可选择的方法获得不同的相互作用结果数据，然后选取其中的子集来分析，尤其是对于那些在正常水平下体内表达的内源性蛋白——这是因为有时某些相互作用会被误认为是过量表达的蛋白。当然选择方法也不能胡乱选择，专家的意见是：如果你首先选了一种体外的方法，那么第二种方法最好是体内方法。

2.利用旁系数据系统进行交叉检查

如果两个蛋白能相互作用，它们应该是存在于同一个地方，并且也应该具有相同的敲除表型，如果不能获得这样的数据，那么至少要与localization，或者（和）RNAi数据进行比对。比如说，如果发现一个能与某个受体相互作用的蛋白，那么你必须证明这个蛋白并不是仅存在于细胞核中，如果那样，则暗示这个相互作用也许不是生理性相关的。

3.定量

一些相互作用的方法只能回答yes或者no，而采用另外一些方法则能得到定量的数据。如果可能的话，应该尽可能的在选择的方法中采用一种定量的方法，保存一些数据，因为说不定什么时候就用得上。像是蛋白芯片的方法，由于点样的时候量是相同的，因此不难获得绑定强度的大小区别。

4.生物信息学分析

生物信息学分析无需具体的实验操作，往往是在整个基因组规模上进行研究，可获得较大的信息量。但是这些方法以基因的同源性为前提，若数据库中没有同源基因则无法比较。目前大规模研究产生的数据都没有达到饱和，整合所有的研究数据而不是分析单一的实验结果，才能得到更加清晰有用的生物学信息。值得一提的是，在细胞中有些蛋白质的相互作用是瞬时的、不稳定的，以实验为基础的研究方法很难捕捉到这种相互作用，而基于生物信息学的分析则能弥补这一不足。

比较有名的三个数据库是BioGRID（www.thebiogrid.org），the Database of Interacting Proteins (DIP, http://dip.doe-mbi.ucla.edu/)，以及The MIPS Mammalian Protein-Protein Interaction Database(http://mips.gsf.de/proj/ppi/) 。其它网站还有：

 

(生物通：张迪)