优化蛋白相互作用实验(二)[创新技巧]

【字体: 时间:2008年10月29日 来源:生物通

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  利用一些方法和手段能避免蛋白相互作用研究方法的短处,利用其长处,这里提及了一些著名实验室采用的方法,以及一些技术上创新的市场产品,希望能有助于您的实验研究。

优化蛋白相互作用实验(一)

3.如何进行信号通路蛋白作用的实验研究?

如何高效、准确地获取生物体内分子间相互作用的信息,是阐明信号转导机制的关键和基础,其中尤其重要的是蛋白之间的相互作用,但是要进行信号通路中蛋白的相互作用研究存在一些难题,比如信号通路中常常包含有膜蛋白和翻译后修饰的蛋白,这两者都不能用Y2H分析,而coIP/MS又很难检测到低丰度的蛋白。

多伦多Mount Sinai医院Samuel Lunenfeld研究中心的Jeff Wrana资深研究员在他的一项研究项目——“绘制哺乳动物细胞信号系统中蛋白相互作用动力学图谱”(研究成果公布在《Science》杂志上(Science, 307:1621-5, 2005))中提出了一种折中的办法:LUMIER (luminescence-based mammalian interactome mapping), 这是一种研究哺乳动物蛋白之间相互作用的自动高通量方法,其中也包含了Y2H和coIP/MS的高通量元素。这种方法中的interactome指的是细胞分子之间的整个分子相互作用,类似于基因组,蛋白质组的英文。

Wrana博士解释道,“质谱分析方法中,是用诱饵蛋白进行IP,然后寻找相关的蛋白,而LUMIER则相反,它完成的是一个不同的问题:A蛋白是否与B蛋白相互作用,而且作用方式是不是相互有关联的?”

将诱饵蛋白(bait)连接上Renilla荧光素酶(Renilla luciferase),而“猎物”或靶蛋白(prey or target protein)——也可以是整个文库——则与一般表位(generic epitope)进行标记。在哺乳动物细胞中同时表达这两个结构,然后裂解细胞,用激活剂(比如TGF-beta)刺激,这样通过anti-epitope(具有荧光素酶活性)的免疫沉淀就可以检测出蛋白相互作用。

LUMIER可以用于哺乳动物细胞,能检测到生长因子依赖性蛋白相互作用,由于LUMIER不需要功能性的readout,因此可以“更加不局限的检测相互作用”,Wrana说,不同于Y2H,“细胞中任何地方都有可能出现相互作用,这种方法对于分析膜蛋白,表达量低的蛋白,或者比较大,多聚体的蛋白十分有效。”

如果想进行这方面的实验,可以向Wrana实验室询要LUMIER载体,另外其中提及的一个重要的报告基因——Renilla荧光素酶是海洋生物Renilla reni-formis等中分离得到的生物荧光素,是一种具有绿色荧光的黄色染料,分子式为C20H12O5,不溶于水、苯和氯仿,溶于冰醋酸等。

比较于细菌荧光素酶和萤火虫荧光素酶,Renilla荧光素酶可以催化肠腔素(coelenterazine)氧化,产物可透过生物膜,可能是最适用于活细胞的报告分子。

在荧光素酶产品方面做的颇为出色的Promega公司有一款Renilla荧光素酶分析系统——这也是唯一的海肾荧光素酶检测试剂盒,这个系统可方便地替代萤火虫报告基因系统,得到可靠的、线性范围超过7个数量级酶浓度的结果。

而且与其它试剂相比,获得专利的海肾荧光素酶检测系统组分配方显著降低了腔肠素(coelenterazine) 的自发荧光影响,比已发表的方法灵敏度高几个数量级,这些都是对于信号通路研究而言是求之不得的优点。

这个试剂盒包括海肾裂解液,海肾荧光素酶检测缓冲液和海肾荧光素酶检测底物,大约为523美元(1000 assays)。


 

4.如何完成膜蛋白相互作用实验?

不消说,做过Y2H实验的人都知道,酵母双杂的一个硬伤就是膜蛋白的分析研究,但是对于具有很多重要生物学功能的细胞膜来说,其功能大多数是由膜蛋白执行的。

为了解决这个难题,加拿大多伦多大学Donnelly细胞和生物分子研究中心的Igor Stagljar教授提出了一种称为膜酵母双杂交(membrane yeast twohybrid,MY TH,生物通译)的方法,并将这种方法应用到了他的研究中,完成了“完整膜蛋白的相互作用蛋白质组学研究”(PNAS 94:5187-92. 1998)。

Stagljar教授在进行现存的生化及遗传学方法分析时,发现这些方法或者不能配合酵母双杂——Y2H不能用于膜蛋白,或者会破坏蛋白复合体——不适用于coIP/MS,因此不得不另想它法。

他发展得到的MY TH方法吸取了Y2H的优点:简便的遗传学操作和适合高通量分析,适用于细胞质中的完整的膜蛋白研究,以及出现在任何细胞位置的膜(比如内质网,高尔基体,和线粒体)结构上的相互作用。Stagljar认为,“这是至今为止,唯一的一种证明能用于研究全长,完整膜蛋白相互作用的筛选系统。”

MYTH原理十分巧妙,应用到了分离泛素系统(split-ubiquitin):将诱饵(bait)即一个完整的膜蛋白,融合到泛素的C末端(这个泛素与一个转录激活因子相连),而“猎物”或靶蛋白(prey or target protein)则融合在泛素的另一半上,bait和prey的相互作用就会让重新构成泛素,从而被一种特异性的蛋白酶(泛素专一性蛋白酶,UBPs)剪切,释放出转录激活因子,这个转录激活因此转移到细胞核上,开启报告基因的表达。

这样双杂交过程就不一定要在细胞核内完成,便于针对那些需要定位到膜上之后才能表现正常生物功能的蛋白质。不过这一方法对于研究哺乳动物蛋白可能比较困难,因为靶标常常需要翻译后修饰,这在酵母中不能实现。

Stagljar的MY TH技术已由瑞士的DualSystems Biotech公司商品化了,这家公司成立于2000年,是从瑞士苏黎世大学独立出来具有自主产权的生物公司。公司的主要业务领域集中在蛋白组学领域产品,包括通过酵母系统进行蛋白质间相互作用研究的产品和服务,cDNA文库构建试剂和服务,在酵母中或E. Coli中进行重组蛋白的制备和纯化,以及一系列相关的试剂和抗体。

这个试剂盒(The DUAL membrane kit 3)既可以用于全长完整的膜蛋白的筛选,也可以进行cDNA文库识别与目的蛋白有相互作用的新蛋白。其特点包括:

  ·可以进行体内全长完整蛋白相互作用分析;
  ·检测到的蛋白相互作用是在细胞膜生理条件下获得的;
  ·通过筛选cDNA文库可以找到新的相互关系;
  ·利用sfi I技术可以简便的完成全长cDNA插入的亚克隆(sfi I为稀有酶切位点);
  ·报告菌株NMY51减少了假阳性的出现。

这个NMY51菌株是DualSystems Biotech开发的一种改良的酵母菌株,有三个独立的报告基因:HIS3, ADE2和 lacZ,第一步通过营养缺陷型报告基因(HIS3, ADE2)进行选择性生长筛选,进一步通过LacZ报告基因进行β-半乳糖分析显色的定量或半定量筛选。由于含有三个独立的报告基因,因此受不同启动子的调控,降低假阳性几率。

这个试剂盒目前价格为3900美元,有兴趣的可以询问一下达科为,目前达科为是其在中国的独家代理商。


 

Tips:

1.至少采用两种互补的方法

最好能通过一些可选择的方法获得不同的相互作用结果数据,然后选取其中的子集来分析,尤其是对于那些在正常水平下体内表达的内源性蛋白——这是因为有时某些相互作用会被误认为是过量表达的蛋白。当然选择方法也不能胡乱选择,专家的意见是:如果你首先选了一种体外的方法,那么第二种方法最好是体内方法。

2.利用旁系数据系统进行交叉检查

如果两个蛋白能相互作用,它们应该是存在于同一个地方,并且也应该具有相同的敲除表型,如果不能获得这样的数据,那么至少要与localization,或者(和)RNAi数据进行比对。比如说,如果发现一个能与某个受体相互作用的蛋白,那么你必须证明这个蛋白并不是仅存在于细胞核中,如果那样,则暗示这个相互作用也许不是生理性相关的。

3.定量

一些相互作用的方法只能回答yes或者no,而采用另外一些方法则能得到定量的数据。如果可能的话,应该尽可能的在选择的方法中采用一种定量的方法,保存一些数据,因为说不定什么时候就用得上。像是蛋白芯片的方法,由于点样的时候量是相同的,因此不难获得绑定强度的大小区别。

4.生物信息学分析

生物信息学分析无需具体的实验操作,往往是在整个基因组规模上进行研究,可获得较大的信息量。但是这些方法以基因的同源性为前提,若数据库中没有同源基因则无法比较。目前大规模研究产生的数据都没有达到饱和,整合所有的研究数据而不是分析单一的实验结果,才能得到更加清晰有用的生物学信息。值得一提的是,在细胞中有些蛋白质的相互作用是瞬时的、不稳定的,以实验为基础的研究方法很难捕捉到这种相互作用,而基于生物信息学的分析则能弥补这一不足。

比较有名的三个数据库是BioGRID(www.thebiogrid.org),the Database of Interacting Proteins (DIP, http://dip.doe-mbi.ucla.edu/),以及The MIPS Mammalian Protein-Protein Interaction Database(http://mips.gsf.de/proj/ppi/) 。其它网站还有:














 

(生物通:张迪)

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