凋亡检测之Promega篇[选购宝典]

Promega这个老牌的生物公司，近来也愈发展现出青春的活力，还将经典的《操作步骤和应用指南》搬上了iPhone，让大家耳目一新。在细胞分析方面，Promega的产品还真不少，覆盖了凋亡、增殖、ADME(吸收、分布、代谢、排泄)、毒性等多个方面。本文详细介绍了Promega的细胞凋亡产品。

Promega这个老牌的生物公司，近来也愈发展现出青春的活力，还将经典的《操作步骤和应用指南》搬上了iPhone，让大家耳目一新。在细胞分析方面，Promega的产品还真不少，覆盖了凋亡、增殖、ADME(吸收、分布、代谢、排泄)、毒性等多个方面。前段时间，生物通还发表了Promega专家所撰写的《在合适的时间点检测凋亡》一文，其中列出了一些可能影响凋亡的因素，如细胞系、诱导剂、处理时间及培养条件，并详细阐述了在合适的时间段检测凋亡的重要性，非常适于新手阅读。

细胞发生凋亡时，除了形态学变化以外，还会发生一系列生化事件。其中，caspase酶的依次激活无疑是凋亡中重要的生化改变。而它们也成为凋亡检测中很好的靶点。检测caspase酶的方法不外乎底物、抑制剂和抗体。

Proemga公司的Caspase-Glo®检测试剂盒是一种检测caspase活性的均质发光检测方法。试剂盒中提供了一种经过修饰的氨基萤光素发光前体底物(含相应的caspase蛋白酶识别序列)和耐热萤光素酶，专利的缓冲液也特别为caspase活性、细胞裂解和萤光素酶活性而优化过。细胞发生凋亡时，caspase酶系即处于活性状态，这些具有活性的caspase酶在遇到氨基萤光素发光前体底物后，在其特异性识别的氨基酸序列处进行切割，释放出游离的氨基萤光素底物，然后，此游离的萤光素底物即可被萤光素酶催化而发光。在缺乏有活性的caspase时，caspase的氨基萤光素前体底物也不能作为萤光素酶的底物，因此不发光。加入Caspase-Glo® 试剂后，细胞裂解，随后caspase将底物裂解。释放出的游离氨基萤光素与Ultra-GloTM 重组萤光素酶作用，产生一种"辉光型"的发光信号（图1）。该信号的强弱与caspase 的活性成正比。

此试剂盒最大的特点是利用了萤光素酶，而不是常规的荧光来检测caspase的活性，因此更为灵敏，且不易被其他化合物的固有荧光信号所干扰，信噪比更高。另外，Caspase-Glo®检测试剂盒使用起来也特别简单，只需将缓冲液和冻干的底物冻干粉混合，再以1:1的比例加入样品中即可，连常规的细胞裂解步骤都省了。整个过程只是“加样-混合-读数”三步而已。Caspase-Glo® 3/7,8和9试剂盒可以用多孔板模式，既可用于纯化的酶的测定，也可直接在用于测定培养的细细胞培养体系中的caspase酶胞中应用。Caspase-Glo® 2和6试剂盒则主要用于检测纯酶制备。

不过，由于涉及到萤光素酶的检测，实验中就需要能读96孔板的发光检测仪（Luminometer）来完成最后的读数。如果你们实验室已经有了这台发光检测仪，那自然皆大欢喜。但由于生物发光还未像荧光那样普及，因此很多实验室可能缺乏这个检测仪器，那只能忍痛割爱，舍弃这个又简单又灵敏的好东西。此时，基于荧光法的caspase检测试剂盒就成了最好的替代。Apo-ONE® Homogeneous Caspase-3/7检测试剂盒是根据对罗丹明标记底物的切割来检测caspase-3/7活性的。此试剂盒的用法也同样简单，与上面的“加样-混合-读数”三步曲相同。总的孵育时间取决于样品中不过，在有活性的caspase-3/和-7的量，较为轻微的凋亡诱导效果以及细胞数量较低时，需要延长孵育时间。推荐的最长孵育时间是18小时。存在时，荧光R110产物会持续积累，因此将最后的孵育时间延长到18个小时能提高信噪比，实现更高的灵敏度。当然，你也可以采用化学发光的方法来检测casepase，或用FITC标记的抑制剂来原位检测caspase的活性。

除了监测caspase的活性，Promega还有一些试剂来监测线粒体中的凋亡指示剂，如细胞色素c。当然，也少不了检测DNA片断化的TUNEL法。DeadEnd™检测系统就是改良的TUNEL法。在此系统中，细胞经过处理，变得使通透性增加，以便标记DNA片断的试剂能够进入细胞。之后，片断化DNA的3’OH端分别加上了荧光素标记（荧光系统）或生物素标记（显色系统）。该系统很适合对组织切片和培养细胞中的凋亡细胞的胞核进行标记，同时还能进行用于形态学评估。《DeadEnd(TM)比色法凋亡检测系统：在病理学中的应用》一文就详细介绍了DeadEnd™检测系统在凋亡的细胞模型、动物模型和多种病理组织切片中的应用。

此外，Promega的专家还建议使用两种或更多的检测方法来验证凋亡。发生凋亡的细胞将最终发生继发性坏死。经过持续的孵育，凋亡细胞最终关闭新陈代谢，失去细胞膜的完整性，并将内含内容物释放到培养基中。凋亡的标志物如caspase活性也只是在某一阶段内短期表达。因此，为了确定凋亡是否是细胞死亡的主要机制，了解细胞死亡过程的动力学非常关键。我们应该从同一个样品中获得多组数据，来进行共同验证。另外，我们也可以将凋亡与细胞活力、毒性分析结合起来，共同评估细胞的状态。

说了这么多，你应该对Promega的凋亡产品有了大致的了解吧。另外，还有个小东西也值得一提。Promega的凋亡小助手（Apoptosis Assistant，http://www.promega.com/apoasst/）--在线的帮助软件能协助你从文献中查找相关的实验信息，连实验优化的时间也节省了。只要你选择诱导剂、细胞类型和凋亡检测试剂，凋亡小助手就会找出文献中曾提到过的凋亡试剂的浓度和诱导时间，以及文献的具体信息。你可以有的放矢地去寻找相关信息，而不再是大海捞针。这样的小工具是不是也特别实用呢？

Promega的产品一向以质优价廉著称，凋亡产品也不例外，相信会是普通实验室的明智之选。

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