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寻找肿瘤蛋白标记物:低丰度蛋白[创新技巧]

【字体: www.ebiotrade.com 时间:2010年01月22日 来源:生物通

摘要:

  一些已有的经验也许能帮助我们更快的找到肿瘤蛋白标记物,比如低丰度蛋白的问题,来自伊丽莎白医院临床肿瘤科的研究人员就针对这一问题提出了一种解决方案。

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生物通报道:从上世纪30年代来,癌症的死亡率没有得到很大的改观。科学家们希望能通过从复杂的生物样本中分离鉴定出敏感特异的肿瘤特有的标记,来帮助肿瘤诊断,评估预后,评估肿瘤的分期,复发,药物靶位点等。

这就是肿瘤标记物,肿瘤标记物首先是通过利用从肿瘤细胞中提取的单克隆抗体发现的。在获得抗血清后,通过免疫吸附去掉正常细胞,留下肿瘤特异性的抗原,筛选并评估这些候选物成为了寻找新的肿瘤标记物的经典方法。但是这种方面费时又耗力,因此寻找一个快速的评估大量潜在的肿瘤标记物方法十分必要。

最开始,科学家们利用的是基因表达谱方法,这种方法能同时分析成千上万个基因的表达水平,但是基因学的最终目标是功能,这却是在蛋白质水平上来体现的,因此只有在蛋白质水平上利用生物样本可以找到有效的可作为疾病标记物的候选蛋白,特别是在利用临床的血和尿的样本时才更有意义。

然而蛋白又不能像DNA那样扩增,而且蛋白种类繁多(包括许多同形异构体),因此要找出癌症病患和健康对照之间的明显分子差异并不一件容易的事情,另外即使研究人员幸运的找到了肿瘤标记物候选因子,也还需要从更多病患中筛选和验证最佳的标记物,这个过程也许需要一个漫长,经年累月的积累。

一些已有的经验也许能帮助我们更快的找到肿瘤蛋白标记物,比如低丰度蛋白的问题,来自伊丽莎白医院临床肿瘤科的研究人员就针对这一问题提出了一种解决方案。

他们的研究课题是比对吸烟的肺癌患者与不吸烟对照组之间的血清蛋白差异,在实验中,研究人员发现通过蛋白分离方法,尤其是为了更高的分辩率,进行了多次分离之后,血清和血浆中一些低丰度蛋白会丢失。而且蛋白分离过程也十分枯燥乏味,成本也不低,因此研究人员希望找出一种方便快捷,能挖掘到低丰度血清蛋白的新方法。

研究人员经过比对验证,发现利用磁珠亲和纯化方法来分离蛋白,与密度梯度离心等方法相比,能提高分离的纯度,减少血清中其它物质的干扰,降低污染,而且更重要的是不会丢失低丰度血清蛋白。

这方面的产品目前市场上也不少,伊丽莎白临床肿瘤科的研究人员推荐了Bio-Rad公司的ProteoMiner protein enrichment kit,和GE的Mag Sepharose磁珠。

其中GE的Mag Sepharose磁珠能通过在磁珠上固定的抗体或其它蛋白,在免疫沉淀或pull-down中捕获目标蛋白,系列产品包括几种形式的磁珠:TiO2 Mag Sepharose(从复杂样品中富集磷酸化肽段),Protein A和Protein G Mag Sepharose(亲和层析填料,通过免疫沉淀捕获目标蛋白),以及NHS Mag Sepharose(可共价偶联任何带自由胺基的蛋白,用于多种类型的pull-down实验)。

这些磁珠能够被磁性装置快速捕获,而肉眼可见的磁珠确保能收集到所有目标蛋白。这样样品中低丰度目标蛋白的浓度可从毫升降低到微升,而在富集和免疫沉淀中只需要少量的捕获抗体。

比如Protein G Mag Sepharose基质中携带了anti-pTyr抗体,可以用于富集磷酸化酪氨酸蛋白,而且操作简单灵活,洗脱方便,可用于后续实验,比如电泳和质谱分析。

而ProteoMiner的作用原理则是基于复杂样品与高度多样的六肽配基之间的相互作用(见下图)。每个ProteoMiner珠子上都有不同的六肽配基,它们与某种蛋白具有特定的亲和性。当一个复杂的蛋白质样品与大量六肽配基共同孵育时,样品中的蛋白质会相应地找到其结合位点而被珠子捕获。由于珠子的结合能力有限,高丰度蛋白迅速饱和了相应配基(红色和黄色珠子),而多余的蛋白就被洗掉。与此相反,低丰度蛋白通过与特定配基(粉色和绿色珠子)的结合而富集。通过这种方式,低丰度蛋白质相对得到了富集与浓缩。具体内容请见生物通文章:揭开低丰度蛋白的秘密

 

(生物通:张迪)

 

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