多重定量PCR的新突破和新应用[创新技巧]

PCR仪在不断改进，多重定量PCR的试剂也在不断丰富，同时，研究人员还在不断开发新的多重分析方法。等位基因特异的甲基化多重qPCR（ASMM RTQ-PCR）是一种新兴的多重PCR技术，一个研究小组证实了它在诊断Beckwith-Wiedemann综合征和Russell-Silver综合征上的有效性。

PCR仪在不断改进，多重定量PCR的试剂也在不断丰富，同时，研究人员还在不断开发新的多重分析方法。

2009年，美国犹他州大学的Richard Cawthon在《核酸研究》上发表了一篇文章，介绍了一种新的单色多重qPCR技术（monochrome multiplex qPCR）1。Cawthon使用了一种单荧光DNA插入染料来测定端粒长度。qPCR分析测定一组反应孔中DNA样品的端粒（T）信号，以及单拷贝基因（S）信号。与参考DNA比较，得出相对的T/S比值，这个比值与端粒平均长度成正比。由于移液过程中DNA量的差异不会改变T/S，因此可实现多重分析。在S信号超过基线之前，收集每个循环的T信号，之后在完全熔解端粒产品的温度下收集S信号。

测量端粒长度并不是目的，只是手段，研究人员更想了解它与疾病的关联。之后，Richard Cawthon联合美国国立癌症研究院的Qing Lan等研究了外周血白细胞中DNA的端粒长度是否能作为非霍奇金淋巴瘤的预测指标2。他们比较了107名非霍奇金淋巴瘤男性患者及相应对照中白细胞DNA的端粒长度。结果表明，更长的端粒与非霍奇金淋巴瘤的风险增加相关。

最近，这些研究人员利用了同样的技术，比较了229个肺癌病例及相应对照中白细胞DNA的端粒长度3。相似地，他们认为，更长的端粒可能与男性吸烟者中肺癌的风险增加相关。

另一种新兴的多重PCR技术是等位基因特异的甲基化多重qPCR（ASMM RTQ-PCR）。一个研究小组证实了它在诊断Beckwith-Wiedemann综合征和Russell-Silver综合征上的有效性4。

Beckwith-Wiedemann综合征（BWS）是一种过度生长综合征，导致身体的全部或者部分生长得比正常的大；而Russell-Silver综合征（RSS）的主要临床表现为胎儿严重的宫内生长发育迟缓及出生后生长发育迟缓和矮身材。

在应用ASMM RTQ-PCR之前，临床实验室主要使用Southern blotting来诊断这两种疾病，但相当繁琐且耗时，有时需要15天才能得到结果。此外，这种方法需要大量的DNA，使用放射性。为此，法国Armand-Trousseau医院的研究人员开发出ASMM RTQ-PCR技术。

研究表明，qPCR方法不仅比Southern blotting更加灵敏，而且是一种快速、可靠且经济高效的诊断方法。通讯作者Irène Netchine谈到：“在研究印记疾病时，ASMM RTQ-PCR与Southern blotting一样强大，甚至比后者更为灵敏，特别是在检测低度LOI时。它只需要少量DNA。这些优点让ASMM RTQ-PCR成为Southern blotting的更佳替代。”

此外，ASMM RTQ-PCR还能够验证全基因组甲基化研究的结果。

组织样品中mRNA水平的测定有助于了解基因的功能，以及它们在疾病中的作用。为此，马里兰大学的研究人员们开发出了2D-RT-qPCR方法5。他们巨解剖（macro-dissect）了组织样品，并保留了RNA的真实位置，而不是使用常用的匀浆方法，那样只能提供整个组织的平均水平。之后，他们在多孔板中纯化了样品，进行RT-qPCR分析。

“我们的目标是定位组织切片中的mRNA，特别是那些需要扩增才能检测的低丰度mRNA，这样你才能将mRNA的位置与肿瘤的位置或特定类型的组织关联起来。维持组织切片的二维空间信息，而不是研磨整个组织切片，取平均值。”马里兰大学的Elisabeth Smela教授如是说。

这有点像原位PCR，但不是在组织内扩增，那样常导致实验失败，Elisabeth Smela教授领导的研究小组将mRNA提取出来，在水状环境中进行扩增。

今年5月，Smela及她的同事在《Analytical and Bioanalytical Chemistry》上发表了数据，证明了这种方法在分析一些组织类型上的有效性。如今，他们正在尝试扩大通量，并提高分辨率。

Smela谈到，她们想要了解，就基因表达而言，组织切片中发生了什么，因此她们试图将分辨率提高至毫米以下，甚至100微米。这种微型化很有挑战性，但是必须解决，才能绘制更高分辨率的图谱。（生物通 薄荷）

参考文献：
1. Richard M. Cawthon. Telomere length measurement by a novel monochrome multiplex quantitative PCR method. Nucleic Acids Res. 2009 February; 37(3): e21.
2. Qing Lan, Richard Cawthon, Min Shen, et al. A Prospective Study of Telomere Length Measured by Monochrome Multiplex Quantitative PCR and Risk of Non-Hodgkin Lymphoma. Clin Cancer Res 2009 December, 15; 7429
3. Min Shen, Richard Cawthon, Nathaniel Rothman, et al. A prospective study of telomere length measured by monochrome multiplex quantitative PCR and risk of lung cancer. Lung cancer 2011 04 ; DOI: 10.1016/j.lungcan.2010.11.009
4. Salah Azzi, et al. Allele-specific methylated multiplex real-time quantitative PCR (ASMM RTQ-PCR), a powerful method for diagnosing loss of imprinting of the 11p15 region in Russell Silver and Beckwith Wiedemann syndromes. Human Mutation. 2011 February; 32(2):249-258.
5. Michael Armani, Michael A Tangrea, Benjamin Shapiro, et al. Quantifying mRNA levels across tissue sections with 2D-RT-qPCR. Analytical and Bioanalytical Chemistry 2011 05; DOI: 10.1007/s00216-011-5062-8

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