定量蛋白质组学之SILAC技术（一）[创新技巧]

作为蛋白质组学研究中一种强有力的工具，质谱在过去很长一段时间内只是用于定性研究，鉴定蛋白质和翻译后修饰。于是，科学家们不断开发出定量蛋白质组学方法，来了解细胞、组织或生物体的整体蛋白质动力学。

早期的蛋白质研究致力于鉴定并了解单个蛋白或蛋白复合物的功能，这些年，仪器和技术的进步大大促进了蛋白质组学研究。十年前，我们或许只能分析数百个蛋白，而如今，我们能分析数千个。在这个分析水平，我们可研究细胞、组织或生物体的整体蛋白动力学。这种蛋白质组的研究，与当今热门的基因组、转录组和代谢组等领域的研究一起，让我们更好地了解了整体的生物过程，以及它们如何应对不同刺激，或在疾病状态下如何改变。

若想了解一个人患病之后，基因表达水平发生了怎样的改变，DNA芯片是一个最常见的选择。然而DNA芯片也许并没有说出全部，因为基因表达的差异并不一定直接对应着蛋白表达的差异。为了更准确地比较两个样本的蛋白水平，科学家们通常使用双向电泳外加质谱，然而流程复杂，通量低，重复性也欠佳。

作为蛋白质组学研究中一种强有力的工具，质谱在过去很长一段时间内只是用于定性研究，鉴定蛋白质和翻译后修饰。为什么不能定量？因为各次运行之间，水解后的肽段在理化性质上表现出很大差异，从而导致质谱响应的变化。此外，质谱只能对样品中的一部分肽段进行分析。于是，科学家们不断开发出定量蛋白质组学方法，来了解细胞、组织或生物体的整体蛋白质动力学。

定量蛋白质组学又分为相对定量和绝对定量。相对定量方法（如SILAC、ICAT、ICPL等）是用来比较样品之间的蛋白或肽段丰度；而在未标记的样品中加标有已知浓度的同位素标记的合成肽段，就实现了目标肽段的绝对定量。

显然，绝对定量比相对定量更为理想，因为不同样品的肽段绝对值也可用于比较相对蛋白变化。然而，相对定量却更为常用，因为每个目的蛋白的绝对定量都需要昂贵的试剂，也需要花费大量的时间来开发分析。在相对定量方法中，SILAC又是比较常用的一种。

SILAC技术的原理

10年前，SILAC诞生于南丹麦大学。它的发明者是Matthias Mann教授。2005年，这位牛人教授来到了德国慕尼黑的马普生物化学研究所。SILAC的全名为stable-isotope labelling by amino acids in cell culture。它的原理很简单：两组细胞同时培养，A组是在包含正常氨基酸（light）的培养基中；B组的培养基则含有“重型（heavy）”的氨基酸，即稳定同位素标记的氨基酸。最初SILAC 使用的标记氨基酸是氚代甲硫氨酸和氘代甘氨酸，目前常用的标记氨基酸有亮氨酸、精氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸和酪氨酸等。细胞传代若干代后，稳定同位素标记的氨基酸完全掺入到蛋白中，取代了原有的氨基酸。这样，两个蛋白之间就存在分子量的改变，而其它化学性质无异。

然后将两组细胞混合，提取出蛋白质组，并交给质谱去测定。每个肽段作为质谱中的一对——低分子量的肽段含有轻型氨基酸，来源于A组，高分子量的肽段则含有重型氨基酸，来源于B组。如果SILAC肽段对呈现1：1的比例，则蛋白质组中此蛋白的丰度无差异。如果含有重型氨基酸的肽段峰强度偏高，则说明B组中蛋白丰度更高。因为稳定同位素标记的氨基酸与天然氨基酸的化学性质基本相同，除了分子量差异，则质谱上峰强度的比值直接对应了A组与B组的比例。虽然整个实验的时间主要取决于细胞生长的速率和所采用的各种样品处理步骤，但一般来说，SILAC实验从开始到结束，包括数据分析，大约需要20到25天。

 
SILAC的流程（图片来自赛默飞世尔）

SILAC方法有很多优势。细胞在传代6-8代之后，蛋白标记效率可达90%以上。标记是在样品处理前引入，随后进行蛋白质分离、酶切和鉴定，后续实验对样品的影响一致，故样品处理所带来的定量误差（bias）会很低。在检测极低水平的蛋白变化或翻译后修饰时，这一点特别有用。此外，SILAC灵敏度高，样本量要求少，通常每个样品只需要几十微克的蛋白量。

当然，这种方法也有限制。一些细胞会将高浓度的精氨酸转化成脯氨酸，这样在精氨酸标记的情况下会产生两个不同的重型峰，代表了精氨酸或脯氨酸标记的肽段。研究人员也开发出一些方法，来避免这种转化。对于那些很难培养，或对培养基成分变化极其敏感的细胞系而言，这种代谢标记的方法也不大奏效。此外，这种技术也有可能影响生物体发挥功能，因为培养条件已改变。（未完，待续）

（生物通 薄荷）

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