定量蛋白质组学之SILAC技术（二）[创新技巧]

作为蛋白质组学研究中一种强有力的工具，质谱在过去很长一段时间内只是用于定性研究，鉴定蛋白质和翻译后修饰。于是，科学家们不断开发出定量蛋白质组学方法，来了解细胞、组织或生物体的整体蛋白质动力学。

经典的SILAC实验

2007年，Matthias Mann教授在《Nature Protocols》上发表了经典SILAC实验的流程。¹ 2-3个样品被分别标记，并在质谱分析中直接比较。来自不同样品的等量细胞或细胞裂解液混合，并在后续步骤中作为单个样品来处理。这样可使用任一种蛋白或肽段富集方法，也不会担心在最后的定量分析中引入定量误差。

经典的SILAC实验（也就是double-SILAC）比较2个或3个样品，但是通过两个triple-SILAC实验，也可以比较5个样品，注意，这两个实验至少有一个共同样品。这在时间进程实验中比较常用。在double-SILAC中，MaxQuant（马普开发的软件包）确定“重型”和“轻型”的肽段比例，而在triple-SILAC中，它确定“重型”与“中等”、“中等”与“轻型”以及“重型”与“轻型”的比例。

动物体的SILAC实验

2008年，Mann的小组及其他小组的研究表明，SILAC也能用于整个小鼠的同位素标记。² Mann小组通过给小鼠提供含有13C6赖氨酸的饲料，将SILAC方法拓展应用于体内研究。通过对小鼠饮食、生长发育、生育能力、活动和生理情况的观测，发现SILAC标记对小鼠后几代都无不利影响。在F2代小鼠体内，他们观察到13C6赖氨酸几乎标记了体内所有器官的蛋白质，使得对这一代和以后若干代小鼠进行定量的蛋白质分析成为可能。

Krüger等人采用了三种基因表达缺陷的小鼠模型对上述方法进行了验证。在每个实验中，差异标记野生型小鼠和基因表达缺陷的小鼠，然后通过质谱检测明确证实了相关组织中相应蛋白质的表达缺失。他们的研究结果表明，体内SILAC标记方法是一种多功能工具，能定量比较缺陷小鼠的蛋白质组，从而确定体内复杂环境中的蛋白功能。

而线虫的定量蛋白质组分析也开展得如火如荼。去年，两个小组都采用氨基酸的稳定同位素标记（SILAC）方法，开展了线虫的定量蛋白质组实验，文章发表在同一期的《Nature Methods》上。

英国邓迪大学的Mark Larance等改良了SILAC方法，用一种重型赖氨酸和重型精氨酸标记的大肠杆菌喂养线虫³。质谱分析表明F1后代中已掺入重型精氨酸和赖氨酸。同时，他们还采用RNAi via feeding策略，靶定了精氨酸-脯氨酸转化过程中必需的鸟氨酸转氨酶基因orn-1。质谱结果表明，这种策略几乎完全避免了精氨酸-脯氨酸的转化。将此方法与定量蛋白质组方法相结合，研究人员还鉴定了线虫的热击反应。

作者认为，他们的SILAC方法为线虫的定量蛋白质组研究带来了很多机会。没有了精氨酸-脯氨酸的转化，SILAC实验可更高效地开展。SILAC技术还能协助确定线虫发育、衰老以及压力过程中的整体蛋白质组变化。

几乎同时，南丹麦大学生物化学与分子生物学系的Julius Fredens等也使用了非常相似的方法。⁴ 他们用重型同位素标记的大肠杆菌喂养线虫，得到了重型同位素赖氨酸标记的线虫。利用标记的线虫和定量蛋白质组方法，他们鉴定出一些蛋白，响应了线虫核激素受体49（NHR-49）的功能丧失。作者认为，定量蛋白质组学与选择性基因敲除的结合使用，是研究线虫的一种强有力工具。（未完，待续）

同主题文章：

定量蛋白质组学之SILAC技术（一）

定量蛋白质组学之SILAC技术（三）

参考文献

1. Ong, S.E. & Mann, M. A practical recipe for stable isotope labeling by amino acids in cell culture (SILAC). Nat. Protoc. 1, 2650-2660 (2007).
2. Krüger, M. et al. SILAC Mouse for Quantitative Proteomics Uncovers Kindlin-3 as an Essential Factor for Red Blood Cell Function. Cell. 134 (2), 353-364 (2008).
3. Larance, M. et al. Stable-isotope labeling with amino acids in nematodes. Nature Methods. 8, 849-851 (2011).
4. Fredens, J. et al. Quantitative proteomics by amino acid labeling in C. elegans. Nature Methods. 8, 845-847 (2011).