FFPE样品制备和分析宝典（三）[心得点评]

本文介绍了制备和保存FFPE样品的方法，其目的在于尽量减少因固定和包埋过程而引起的DNA、RNA和蛋白质量下降。之后介绍了流程中的提取和分析步骤，并详细介绍了如何高效地从FFPE样品中回收可分析的生物分子，以及需要作出哪些必要的修改，以便开展逆转录和实时定量PCR等下游应用。专家巨献，FFPE分析宝典，绝对不容错过！

全世界福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）组织切片的存档代表了珍贵且来源广泛的生物医学研究材料。随着越来越多的研究人员转向FFPE样品的分子分析，开发特定的操作步骤，考虑这些样品的独特性质就变得越来越重要。

FFPE样品制备和分析宝典（一）

FFPE样品制备和分析宝典（二）

二、从FFPE样品中提取有用分析物的的关键因素

从FFPE样品中纯化DNA、RNA和蛋白时，目前存在一些主要困难。首先，这些生物分子彼此交联。交联程度和不可逆交联的比例取决于，或部分取决于，福尔马林固定的持续时间。其次，核酸常常严重片段化，这取决于FFPE样品如何制备和保存。第三，由于FFPE样品很珍贵，故只有有限的材料可用于分析物纯化和下游分析。因此，所用的纯化步骤必须是高效的，尽可能多地回收有用的分析物。本章介绍了从FFPE样品中纯化DNA、RNA和蛋白的独特挑战，以及如何最有效地克服它们。

5 总RNA和miRNA的纯化

甲醛修饰会影响FFPE样品中的DNA，这个问题也同样适用于RNA。全新经过优化的RNeasy FFPE Kit和miRNeasy FFPE Kit都是专门为FFPE样品的RNA纯化而设计的（图11和12）。由于RNA在热处理时更容易片段化，故试剂盒使用了经过优化的缓冲液条件，并降低了孵育温度。尽管80°C以上的孵育会略微改善RNA在RT-PCR中的表现，但它还是会导致更多RNA片段化。同时，在较低温度下孵育会导致产量较低，且RT-PCR表现明显变差。

FFPE样品先用蛋白酶K在56°C消化15分钟，以便从交联的蛋白分子中释放RNA分子，之后在80°C孵育15分钟，以逆转一些甲醛修饰。接着，为避免DNA污染，特别是去除有可能干扰下游分析（如实时定量RT-PCR）的痕量DNA小片段，用DNase Booster和DNase处理RNA。在接下来的步骤中，利用RNeasy MinElute离心柱纯化RNA，其中RNA经过结合、洗涤，最终洗脱在15-30 μl无RNase的水中。取决于结合条件，低至70 nt的总RNA（RNeasy FFPE Kit）或包含低至18 nt的miRNA的总RNA（miRNeasy FFPE Kit）被纯化。鉴于RNA的片段化性质，尝试纯化单独的、富含小RNA的部分是不切实际的。为了提高标准化和便利性，RNeasy FFPE Kit和miRNeasy FFPE Kit所开展的RNA纯化必要时也可在QIAcube上自动开展。

图11. 来自FFPE样品的RNA的实时定量RT-PCR分析。利用RNeasy FFPE Kit从大鼠肾脏中纯化总RNA。在Rotor-Gene® Q循环仪上开展PGK1（磷酸甘油酸激酶1）的实时定量RT-PCR分析，加（+RT）或不加（-RT）逆转录酶。-RT曲线证明了利用RNeasy FFPE Kit纯化的RNA几乎不含基因组DNA。

图12. 从FFPE组织中高效纯化miRNA。大鼠肝脏组织用福尔马林固定24小时或60小时，接着用miRNeasy FFPE Kit纯化包括miRNA在内的总RNA。纯化所得的RNA作为模板，并利用miScript PCR System开展实时定量RT-PCR，以检测miR-16和miR-29a以及较大的PGK1基因mRNA。结果表明了同一洗脱液中miRNA以及mRNA的成功检测。

6 蛋白的纯化

与核酸不同，FFPE样品中的蛋白不会遇到片段化的问题。因此，全长蛋白的分离是可以实现的。然而，从FFPE样品中抽提蛋白时，也会面临一些重要的问题。首先，如果下游应用需要样品裂解液，而不是高度纯化的蛋白，则石蜡的彻底去除是必需的。其次，蛋白酶K和高度变性剂不能用来断开福尔马林交联，因为它们会导致蛋白降解。

蛋白纯化的效率受到切片厚度的影响。我们建议样品厚度在10-15 μm。产量取决于切片中组织的量和组织的性质。肝脏组织的3块10 μm切片的一般产量为1.5 μg/μl，而大脑组织为1.6 μg/μl。

Qproteome FFPE Tissue Kit利用专利技术从FFPE样品中高效回收全长蛋白。在二甲苯多次处理去除石蜡后，组织切片在优化的提取缓冲液中孵育2次。第一次是100°C、20分钟，以逆转福尔马林交联。第二次是80°C、2小时，以确保蛋白溶解度最高。最终获得了100 μl包含蛋白的裂解液，适用于质谱和western blot分析等应用（图13）。

图13. 乳腺癌活检中HER2的检测。利用Qproteome FFPE Tissue Kit处理8个FFPE乳腺组织，并通过SDS-PAGE分离蛋白。在western blotting之后，与HER2（上图）或β-actin（下图，对照）抗体杂交。在从FFPE组织提取的蛋白样品中，可检测到HER的p185和p95形式。（数据由德国慕尼黑理工大学的Karl-Friedrich Becker和Christina Schott友情提供。）

Qproteome FFPE Tissue 2D-PAGE Kit提取的蛋白适用于2D-PAGE。在为2D-PAGE样品专门开发的脱蜡步骤后，使用与Qproteome FFPE Tissue Kit相同的提取缓冲液逆转福尔马林交联。回收后的蛋白可脱盐，以去除可能影响下游2D-PAGE分析的盐。纯化的蛋白同样适用于质谱分析（图14）。

图14. 来自FFPE和新鲜冰冻样品的蛋白的质谱分析。利用Qproteome FFPE Tissue 2D-PAGE Kit从FFPE和新鲜冰冻的大鼠肝脏中纯化蛋白。3块150 mm2 FFPE组织切片的蛋白产量是80 μg。图中显示了A 水解FFPE和B 新鲜肝脏组织的LC耦合串联质谱分析的总离子流图。160分钟内上样的LC梯度是5%-40%溶剂B。分析是在Orbitrap™ XL质谱仪（赛默飞世尔科技）上开展的，将5 μg胰蛋白酶水解肽段混合物上样到与质谱仪耦合的HPLC柱中，这些肽段来自从A FFPE或B 新鲜冰冻组织中提取的蛋白水解产物。在分析相同量的起始材料时，新鲜冰冻和FFPE组织都鉴定出大约86.7%的总蛋白。（数据引用自Geoui, T. et al. [2010] Extraction of Proteins from Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded Tissue Using the Qproteome Extraction Technique and Preparation of Tryptic Peptides for Liquid Chromatography/Mass Spectrometry Analysis. Curr. Protoc. Mol. Biol. 90, 10.27.1）

7 多个分析物的同时纯化

如果能够同一个FFPE样品中纯化得到DNA和RNA，那么可以实现基因组和转录组数据的可靠比较。在研究健康和恶性细胞呈异质性分布的肿瘤组织时，这尤为重要：它意味着同一个样品的不同切片可能在细胞组成上存在不同。将样品分成两半，进行不同的DNA和RNA纯化操作，会导致不同细胞群体的DNA和RNA的纯化，而它们的性质可能不同。从同一个样品中纯化DNA和RNA可避免浪费，因为FFPE样品很珍贵，往往难以提取，且数量有限。

然而，从同一个样品中分离DNA和RNA存在一个主要障碍：片段化的DNA很短，且部分是单链的，因此与RNA更为相似。片段化DNA的这种性质造成DNA和RNA的物理分离十分困难。AllPrep® DNA/RNA FFPE Kit利用一种专利申请中的溶解方法来分别释放单个FFPE样品中的DNA和RNA。通过这种方法，FFPE样品在一种经过优化的裂解液中孵育，导致RNA的释放和DNA的沉淀。离心之后，包含RNA的上清和包含DNA的沉淀可分别处理，以纯化RNA和DNA。进一步孵育部分逆转了交联，之后利用RNeasy MinElute离心柱或QIAamp MinElute离心柱纯化RNA或DNA。对于纯化后的RNA，柱上DNase处理可高效去除任何污染的DNA（图16C）。

取决于RNA结合条件，小的RNA如miRNA可能存在于纯化后的RNA中，也可能不存在。对于纯化后的DNA，可选择柱上RNase处理，因为离心柱处理之前的DNA和RNA分离，RNA污染很少。

利用AllPrep DNA/RNA FFPE Kit纯化得到的DNA和RNA与分别利用QIAamp DNA FFPE Tissue Kit和RNeasy FFPE Kit/miRNeasy FFPE Kit纯化得到的DNA和RNA质量相当（图15）。因此，纯化得到的核酸适合实时定量PCR和RT-PCR（图16）或焦磷酸测序等下游应用。

图15. FFPE样品中DNA和RNA的纯化。A 从各种大鼠FFPE组织中纯化的基因组DNA在室温下保存指定时间。纯化是利用AllPrep DNA/RNA FFPE Kit或QIAamp DNA FFPE Tissue Kit（作为对照，一个专门从FFPE样品中纯化DNA的试剂盒）开展的，两者都包含了RNase消化。通过测量吸光度来确定每个20 μm 切片样品的DNA产量。B 从各种大鼠FFPE组织中纯化的RNA在室温下保存指定时间。纯化是利用AllPrep DNA/RNA FFPE Kit或RNeasy FFPE Kit（作为对照，一个专门从FFPE样品中纯化RNA的试剂盒）开展的。通过测量吸光度来确定每个10 μm 切片样品的RNA产量。在回收FFPE样品中的DNA/RNA时，AllPrep试剂盒的表现与专门的DNA/RNA纯化试剂盒一样好。

图16. FFPE样品中DNA和RNA的可靠扩增。利用AllPrep DNA/RNA FFPE Kit或作为对照的专门从FFPE样品中纯化DNA或RNA的试剂盒（QIAamp DNA FFPE Tissue Kit或RNeasy FFPE Kit）从各种大鼠FFPE组织中纯化A DNA和B, C RNA。在ABI PRISM® 7900HT 序列检测系统上开展实时定量PCR或RT-PCR，A 利用QuantiTect SYBR Green PCR Kit来分析Prnp基因的78 bp扩增子，或B, C 利用QuantiTect SYBR Green RT-PCR Kit来分析Jun癌基因表达。AllPrep试剂盒和专门的试剂盒产生了相当的CT值，说明所有试剂盒在回收可用的DNA或RNA上效率相似。C 此外，Jun表达的分析在无逆转录酶（-RT）下开展。脾脏样品（富含DNA的组织）的扩增曲线表明几乎没有基因组DNA污染。

8 提取和纯化的自动化

FFPE分析物纯化的自动化具有一些优势，包括纯化过程标准化的提高和劳动力的降低。它还有利于多个样品的处理。QIAcube让QIAGEN离心柱试剂盒自动化，包括QIAamp DNA FFPE Tissue Kit、RNeasy FFPE Kit和miRNeasy FFPE Kit，让您快速启动低通量的自动化纯化（每次最多运行12个样品）。对于低-中等通量的FFPE样品的DNA纯化，EZ1® Advanced仪器每次运行可纯化1-6或1-14个FFPE样品，它使用EZ1 DNA Paraffin Section Card和EZ1 DNA Tissue Kit。EZ1 Advanced仪器带来了高的操作安全性，无忧的数据管理和快速运行时间。

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原文《Critical factors for molecular analysis of FFPE samples》由QIAGEN提供，生物通负责编译。

（未完，待续）