论文昭示儿童转基因大米实验方法

【字体: 时间:2012年09月05日 来源:生物通

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  氘标记的黄金大米(GR)谷粒和菠菜是从一种水培植物系统(位于休斯顿的USDA-农业研究服务儿童营养研究中心)中收集的,用重水(氧化氘,D2O)培养植物,在刚埋入种子(在水稻箱)或种植开始(菠菜)后即引入生长培养基……

  

背景介绍: 利用儿童实验的转基因大米论文全文(一)

对象与方法

对象

研究是在中国湖南省的一所小学开展的,对象是年龄在6-8岁的健康小学生(有着正常的生化检测结果;如下),无寄生虫感染,或用阿苯达唑(葛兰素史克)治疗后证实无感染。大部分居民是本地农村的劳动人民,收入中等。48%的研究对象在治疗(无副作用)后被招募,在研究餐开始前的一个月参与研究。因此,研究时的所有研究对象经过实验室检测,均无寄生虫感染。当地每年对所有儿童进行健康评估和生物医学检测(白细胞计数、血红蛋白计数、血小板计数、红细胞计数和红细胞压积)。

为了评估研究的样本大小,我们使用了过去美国的菠菜或β-胡萝卜素胶囊研究(26,27)和中国的深绿色蔬菜研究(28)进行power计算。我们发现,为了确定两个类别的差异——边缘和正常维生素A摄入,我们需要每个类别30个的样本大小,为了评估各种来源的食物机制的效果(菠菜、黄金大米和β-胡萝卜素胶囊),我们需要每组10个。考虑到对象退出研究的可能性,我们提议边缘维生素A组有36个对象,正常维生素A组有36个对象,而菠菜组、大米组和β-胡萝卜素胶囊组每组有12个。

在筛查的总共112个对象中,72个参加了研究,并从68个对象中采集了足够的血清样本(每个对象在1-5个时间点之间变化),便于HPLC和气相色谱-质谱分析。对象的人体测量是在全中国这一年龄组所报告的数据范围内(29)。研究招募过程和实验步骤经过了美国机构审查委员会-塔尔茨医学中心和中国浙江省医学科学院伦理审查委员会的批准。所有家长和学生都同意参加本研究。

内标记植物材料的生产和标记剂量的制备

氘标记的黄金大米(GR)谷粒和菠菜是从一种水培植物系统(位于休斯顿的USDA-农业研究服务儿童营养研究中心)中收集的,用重水(氧化氘,D2O)培养植物,在刚埋入种子(在水稻箱)或种植开始(菠菜)后即引入生长培养基,如之前所述(26)。在成熟期收获GR谷粒,空气干燥3天,随后去壳、研磨并储存在-70℃,直至运输到波士顿煮熟,如之前所述(25)。类似地,菠菜收获后包装新鲜的叶子(用冰),隔天运输到波士顿烹饪和处理,如之前所述(26)。

煮熟的GR被分成60g小份(煮熟重量),装在单个食物容器中,放在-70℃至食用。在吃的当天,GR剂量移至室温,并用蒸汽短暂加热,之后作为午餐提供。

煮熟、标记的菠菜被匀浆、混合,并分成30g小份,装在单个食物容器中,放在-70℃至食用。在吃的当天,菠菜剂量移至室温,并用蒸汽短暂加热,之后作为午餐提供。

纯的2H8-β-胡萝卜素剂量是全反式[2H8] β-胡萝卜素结晶(11,11#,19,19,19,19#,19#,19#-[2H8] β-胡萝卜素),它是由BASF的科学家合成的。化学纯度为91.2%(这一百分比被用于计算剂量中的β-胡萝卜素)。利用梅特勒-托利多的XP-26微量天平称量0.50 mg β-胡萝卜素,其测量可读性达0.001-mg,并用10 mL无水乙醇溶解,再与170 mg玉米油混合形成透明油溶液,从而制成油软胶囊(明胶,尺寸1)中的[2H8] β-胡萝卜素。这些植物食物的β-胡萝卜素富集谱以及研究中的纯β-胡萝卜素是通过液相色谱 – 大气压化学电离质谱分析的,如图1所示。

作为参考剂量,0.5 mg [13C10]维生素A(8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 19, 20- [13C10]视黄醇乙酸酯),其化学纯度为98%,同位素纯度为99%(由剑桥同位素实验室合成),溶于170-mg玉米油明胶胶囊(大小3)中,被志愿者在早餐时摄取。研究剂量与PolarPack冰块一起置于冰盒中,预冷到-70℃,运输到中国的研究地点,其中剂量被放置在-20℃,在食用前不久取出。

研究设计

对象被随机分配(利用计算机生成的随机号码表)到食用菠菜、GR或β-胡萝卜素油软胶囊。整个研究持续了35天,包含了一个14天的食物制备阶段,在此期间,儿童(无寄生虫感染)试吃了厨房提供的研究膳食,并且在此期间,父母被告知孩子的饮食限制。整个研究还包含了一个dosing day(第0天)以及一个21天的周期,从每个对象中最多抽取5个血液样品,以研究血液反应曲线。细节如图2所示。

在研究第0天的0700-0800,儿童摄入了[13C10]维生素A(0.5 mg)及10 mL豆奶,他们的标准化早餐包含米粉(200g、煮熟)、猪肉(110g、煮熟)、半个苹果和26-g曲奇饼干。这一餐的总能量为630 kcal,其中20%来自脂肪。标准化午餐在1145与1230之间,包含大米(250 g、煮熟)、猪肉(100 g、煮熟)、卷心菜(100 g、煮熟)、番茄蛋汤(100 g),其总能量约为560 kcal,其中20%来自脂肪,由研究对象与研究剂量的菠菜(30 g)、一颗β-胡萝卜素胶囊或GR(60 g)一起摄入。对于菠菜或β-胡萝卜素小组,在午餐中还加入了适当量的白米饭,以确保热量与60-g GR小组相同。根据整个小组的食物记录,每个人平均每天从对象的日常膳食中摄入的维生素A约为240 μg视黄醇,为此年龄组的中国营养素建议摄入量700 μg视黄醇的34%。在3周的研究过程中,对象每周5天全在学校吃饭。在家吃饭时,建议不给富含维生素A或维生素A原的食物(如肝脏、过量的胡萝卜)。周末所吃的食物被记录在带回家的日记上。

在实验阶段的第1、3、7、14和21天早上试图从每个对象中抽取空腹血液样本(3 mL,某些对象较少)(图2),根据之间的描述进行分析(26)。

(生物通 薄荷)

结果: 利用儿童实验的转基因大米论文全文(三)

分析: 利用儿童实验的转基因大米论文全文(四)

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