《相约2015NSFC》之miRNA研究经典案例

随着2015年的自然科学基金申请日期的日益临近，广大科研工作者将开始新一轮的基金申请准备工作。锐博生物根据当前医学生物领域的热门研究方向，将陆续推出一系列的研究方案，内容涵盖《疾病相关lncRNA研究策略》、《疾病相关miRNA研究策略》、《siRNA文库高通量筛选策略》、《疾病相关Exosome研究策略》、《中医药分子水平作用机制研究策略》等，为科研工作者的课题申请提供参考，敬请关注！

案例一：miRNA显现治疗骨病巨大潜力

研究者用qPCR检测了骨髓中破骨细胞在刺激物处理后与癌症相关的miRNA丰度变化，发现序列保守的miR-34a与破骨细胞生长呈负相关关系，进一步体内及体外实验也证明miR-34a会抑制破骨细胞产生。另外，通过构建miR-34a敲除及杂合小鼠，检测血清中骨转移标志物CTX-1（carboxy-terminal telopeptides of type I collagen），发现miR-34a在抑制破骨细胞生长的同时，也一并抑制了破骨细胞所参与的骨吸收作用，从而在不影响成骨细胞数目、骨骼生产速度和骨矿沉积率的情况下，增加骨量。

初步了解了miR-34a的功能之后，研究者希望了解miR-34a是否可以作为某些骨吸收相关疾病的标志物。他们使用一类无毒壳聚糖纳米颗粒修饰的miR-34a mimics（miR-34a-CH）处理卵巢切除小鼠（OVX小鼠），力图了解miR-34a对骨吸收相关的骨质疏松症的调控。结果表明，小鼠卵巢切除所引起的CTX-1上升被显著遏制，骨缺失得到修复，骨生成增加，骨量提高；此后，在两类癌细胞移植动物模型活体成像实验中，研究者发现miR-34a-CH处理可以明显减弱癌细胞骨转移， 同时还会抑制肿瘤生长及癌细胞向其他器官，但如果在注射之前用miR-34a-CH提前处理癌细胞，则不会有这类效果。这些结果说明，miR-34a确实会通过对破骨细胞及骨吸收的调控，影响骨质疏松症及癌细胞骨转移。

最后，研究者使用软件预测、qPCR、3’UTR荧光素酶报告基因等经典手段，发现破骨细胞中的转化生长因子-β诱导因子2（transforming growth factor-b-induced factor 2，Tgif2）是miR-34a在破骨细胞中的直接靶基因。敲除Tgif2可以降低小鼠骨吸收，减少破骨细胞，若同时敲除Tgif2及miR-34a，小鼠骨吸收及破骨细胞亦不会增加；进一步的分析发现，Tgif2是一个破骨细胞调控因子，会与某些转录因子形成一个正反馈回路，加强破骨细胞生成。miR-34a即通过调控此靶点，利用其信号通路，对破骨细胞和骨吸收产生影响。

 
miR-34a对破骨细胞及骨吸收调控示意图

相关文献：Krzeszinski J Y, Wei W, Huynh H D, et al. miR-34a blocks osteoporosis and bone metastasis by inhibiting osteoclastogenesis and Tgif2[J]. Nature, 2014, 512(7515): 431-435.

案例二：miRNA对肿瘤干细胞的影响

在肿瘤组织中存在一类数目极少的肿瘤干细胞，它具有与其他干细胞非常相似的特征：分化程度低、具有多向分化潜能、自我更新能力强等等。虽然这类细胞在肿瘤组织中数目很少，但却对肿瘤的发生、发展及转移起到了至关重要的作用，而且常常使肿瘤细胞产生化疗耐药性，导致复发。所以，彻底消灭干细胞是治疗肿瘤的一个关键因素，该方面的研究，也一直是科学家关注的重点。

本项研究中，研究者通过组织芯片分析多例HCC临床样本，发现miR-429会促进HCC细胞转移，并诱导其产生恶性特征，影响病人预后效果及存活率，且在体外培养的HCC细胞中，发现携带有肝脏T-ICs标志物EPCAM+的HCC细胞中干细胞相关基因同miR-429表现出正相关，此类细胞比例也会随着miR-429的表达而上升。如果使用miR-429 mimics/antagomir处理EPCAM-或EPCAM+ HCCLM3细胞，发现miR-429 antagomir会阻止细胞增殖、抑制肿瘤生长、降低EPCAM+细胞比例、阻碍干细胞相关基因表达，动物异植瘤实验结果亦然，而miR-429 mimics则会产生完全相反的结果。另外，通过荧光标记检测miR-429高表达HCC细胞所分泌的微体和外泌体，发现miR-429会被包装进入外泌体或微体内，通过胞间通讯，进入其他细胞，从而逐渐形成一个肝脏T-ICs微环境。这些实验证明，miR-429会促进肝脏T-ICs产生，它与HCC较差预后有确定关联。

进一步通过qPCR及测序分析miR-429 mimics/antagomir处理后的HCC细胞，再结合Western Blot及荧光素酶报告载体，确认RBBP4这个肿瘤抑制蛋白是miR-429的直接靶基因，在HCC细胞内，miR-429会抑制一个肿瘤抑制蛋白RBBP4的表达，从而阻止RBBP4与RB1结合产生脱乙酰基酶复合体，并进一步增强另一个干细胞调控因子E2F1的转录活性。利用ChIP实验，发现被miR-429激活的E2F1会在OCT4基因启动子区域富集，提高OCT4基因转录活性。由于OCT4基因是干细胞保持分化潜能及HCC化疗耐药性的一个关键调控因子，因此，miR-429即是通过提高OCT4转录活性，达到促进肝脏T-ICs生成的效果。

   

Antagomir-429在肝脏T-ICs中表现出对miR-429明显的抑制作用

在其他研究中，miR-429同家族成员在其他癌细胞中会通过非正常去甲基化过表达。利用Mass array技术，证实HCC细胞中miR-429同样是通过非正常去甲基化和低甲基化达到高表达目的。 

 
miR-429/RBBP4/E2F1/OCT4调控通路示意图

最终，研究者发现了miR-429/RBBP4/E2F1/OCT4调控通路，确定了miR-429对于肝脏T-ICs的调控机制。这项研究对肝脏T-ICs调控机制研究起到了非常大的推动作用，未来或许可以通过更深入的研究，研发直接靶向作用于miR-429的核酸类药物，阻碍T-ICs产生，更好地治疗HCC。

相关文献：Li L, Tang J, Zhang B, et al. Epigenetic modification of MiR-429 promotes liver tumour-initiating cell properties by targeting Rb binding protein 4[J]. Gut, 2014: gutjnl-2013-305715.

案例三：miRNA成为食管癌发生新元凶

在细胞中存在一类重要的膜结合信号分子磷酸肌醇（phosphoinositide, PI），它会通过自身磷酸化水平变化产生信号，调控很多重要的细胞生理过程。而其自身磷酸化水平变化又是由细胞中的某些磷酸激酶和磷酸酶保持平衡，例如，磷脂酰-3,4-二磷酸[PI(3,4)P2]和磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸[PI(3,4,5)P3]直接直接由PI3K磷酸化，与蛋白激酶B（protein kinase B, Akt）直接作用，导致Akt激酶活化。活化的Akt进一步造成多个下游因子磷酸化，一起促进细胞强有力的增殖和抗凋亡能力。如果这个平衡被打破，PI3K/Akt通路将不再受到控制。很多种癌细胞中都已经发现PI3K/Akt失控，造成较差的预后效果。

在本项研究中，研究者首先发现，ESCC发展过程中，胞内一种PI3K/Akt信号通路负向调控因子INPP5J出现了明显的下调，但其mRNA并没有响应减少，研究者认为是转录后调控机制对INNP5J产生了影响；通过分析公开的miRNA芯片数据，再结合软件预测和验证实验，证实在ESCC发生过程中，miR-508会出现过表达，且INNP5J是miR-508的直接靶点；通过同样策略，研究者又进一步证实，除了INNP5J，另外两个磷酸酶PTEN和INPP4A也同样受到过表达miR-508的抑制。miR-508对这三个PI3K/Akt通路负向调控因子的抑制，可以维持磷酸肌醇的磷酸化状态，持续激活Akt，大幅提高细胞的增殖、抗凋亡能力，使细胞产生侵略性，并最终形成癌症。

相关文献：Lin C, Liu A, Zhu J, et al. miR-508 sustains phosphoinositide signalling and promotes aggressive phenotype of oesophageal squamous cell carcinoma[J]. Nature communications, 2014, 5.

案例四：miRNA或将成为急性髓性白血病核酸药物治疗靶点

对于BAALC基因在白血病细胞中的作用已经进行了广泛研究，但人们一直未能阐明BAALC的独立致癌机制。而之前研究已发现，BAALC基因一号内含子所编码的miR-3151对AML不良预后会产生独立影响，只有三分之一的AML病人体内miR-3151和BAALC转录本丰度一致，且miR-3151与BAALC表达量都很高时病人预后效果最差。研究者以此假设，miR-3151才是miR-3151/BAALC这个双产物基因的真正致癌驱动力。

利用miRNA表达谱芯片，研究者对来自179个CN-AML病人样本进行筛选，发现TP53这个重要的抑癌因子所参与的通路与miR-3151相关性最高，且在TP53基因的3’UTR区域发现了两个miR-3151的结合位点。接下来，研究者又检测了TP53通路相关的30个基因变化情况。使用miR-3151慢病毒对AML病人体内分离出的胚细胞进行转染来上调miR-3151，qRT-PCR及Western Blot检测后发现，30个TP53通路相关基因中，包括TP53基因在内，有15个下调，9个上调，软件分析15个下调基因发现，除了TP53，还有7个基因的3’UTR区域也有miR-3151结合位点，可能是其潜在靶基因。而如果使用慢病毒敲除癌细胞中miR-3151/BAALC，发现7个TP53通路相关基因表达量显著提高。再结合克隆了TP53 3’UTR区域的荧光素酶报告质粒验证，初步确认TP53是miR-3151的靶基因。而进一步的体外实验及体内实验都证明，miR-3151会促进癌细胞增殖，抑制癌细胞凋亡，提高癌细胞迁移性，影响预后效果。

最后，研究者希望了解miR-3151基因的调控机制。他们利用ChIP分析了AML细胞内miR-3151两个TSS附近组蛋白修饰富集水平，结果表明在两个TSS处都出现H3K4和Pol II富集，表现出转录活性，使用软件预测，发现SP1、RUNX1及NF-κB最有可能是miR-3151两个TSS处的转录因子。通过构建TSS-3151和TSS-BAALC荧光素酶报告质粒及后续的凝胶阻滞电泳（EMSA），发现SP1和NF-κB（p65）是作为复合体结合到miR-3151的两个TSS上， 参与miR-3151表达调控，而RUNX1则只参与BAALC表达。这些结果也解释了一些AML病人体内miR-3151和BAALC表达量不一致的现象。

由此，miR-3151/BAALC基因对AML发生的角色已经较为明晰，miR-3151才是miR-3151/BAALC真正致癌驱动力，并且直接作用于TP53基因，引起该基因所参与通路内多个基因下调，导致该通路所调控的细胞凋亡受到抑制，最终影响AML病人预后效果。miR-3151的表达受到SP1/NF-κB复合体的调控，未来可通过抑制SP1/NF-κB，降低miR-3151，进一步抑制AML发生。

使用慢病毒在两种AML细胞中提升miR-3151、BAALC表达量或同时提升二者表达量时，TP53基因mRNA变化

 
miR-3151致瘤性体内实验结果

 
细胞凋亡通路效应物CASP3/7活性与miRNA-3151关系

 
miRNA基因TSS处ChIP结果

相关文献：Eisfeld A K, Schwind S, Patel R, et al. Intronic miR-3151 Within BAALC Drives Leukemogenesis by Deregulating the TP53 Pathway[J]. Science signaling, 2014, 7(321): ra36.

案例五：miRNA具有抵御HIV病毒感染能力

已有研究表明，RNA-蛋白交互作用在HIV病毒颗粒形成过程中扮演着重要的角色。HIV-1 Gag是HIV的主要结构蛋白，具备RNA 结合位点 (nucleocapsid domain, NC)。通过与HIV RNA结合, Gag蛋白能以RNA 为支架， 在宿主细胞膜上大量聚合, 最终形成含有数千个Gag的病毒颗粒 。进一步的研究表明，Gag在聚合过程中会与其它RNA非特异性结合，将RNA作为支持物进行聚合。RNA链越长，Gag聚合越多，所形成的病毒颗粒越大。研究者首先提出假设，如果提高细胞自身某些特殊miRNA，可能迫使miRNA与HIV-1 Gag蛋白非特异性地结合，从而干扰Gag与作为支撑骨架的RNA 的结合，阻止Gag聚合，最终达到抑制HIV病毒颗粒形成和传播的目的。

结合高分辨率荧光显微镜技术，研究者首先证实，在不改变Gag mRNA丰度的情况下，通过提升一些宿主细胞低表达或不表达、且在HIV病毒基因组转录本上没有结合位点的miRNA丰度，能抑制新生HIV病毒颗粒的释放能力；进一步通过基因敲除、FISH、co-IP等实验，研究者证实，包括miR-146a、miR-17、miR-19及miR-16等几个miRNA都通过miRNA沉默复合体与Gag结合，破坏Gag聚合组装, 使病毒颗粒无法有效释放。而组装失败的Gag平台将无法抵抗细胞的内吞机制(endocytosis)，被聚集在溶酶体(lysosomes)降解。

对于miRNA功能的普遍认识不同，本研究证明miRNA除了通过miRNA沉默复合体结合于靶基因的3’UTR区域种子序列来起到特殊调控作用外，亦可以作为配体与某些特殊的蛋白质受体结合，发挥一些特殊功能。本项研究对于阻止HIV及其他逆转录病毒自我复制与扩散提供了新的思路，在未来研究者或许可以针对这些miRNA开发设计新型抗逆转录病毒药物。

相关文献：Chen A K, Sengupta P, Waki K, et al. MicroRNA binding to the HIV-1 Gag protein inhibits Gag assembly and virus production[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2014, 111(26): E2676-E2683.

Tips：miRNA动物实验解决方案

实验方通过对前期多项动物实验资料的汇总分析，锐博生物总结出以下两套经典的实验方案供研究人员参考：

一、局部给药： 适应模型：大脑、肌肉、皮肤、眼睛、鼻腔、耳蜗、移植瘤、生殖器等局部组织

操作指导：以移植瘤为例

1）注射体积和剂量：
注射体积20μl至50μl，常用注射体积为50μl；如果肿瘤体积较小，为了减少注射后出现反流，可选择低量注射体积。对于初次操作的人员，可以事先在建好的移植瘤模型上注射灭菌PBS或者注射用生理盐水，作为注射操作的预实验。

miRNA agomir推荐剂量：每次注射1~5nmol；miRNA antagomir推荐剂量：每次注射5~20nmol。

2）注射剂的配制：
以10nmol agomir冻干粉一管为例，离心后先加入50μl RNase free水进行稀释。如实验组为5只裸鼠，用量为1nmol/只，则取5μl分装冻存。注射时，加入225μl PBS或注射用胜利盐水进行稀释，取50μl在瘤体内进行多点注射，可注射3~4处；如果是一次性用完，可直接加入灭菌PBS或者注射用生理盐水进行稀释。

注： miRNA agomir和antagomir由于涉及多种化学修饰，要避免反复冻融。如果分装规格较大，第一次稀释后需要进行分装，分装剂量按照实验动物的数量来确定，尽量让解冻的试剂一次用完。

3）注射时间：
裸鼠后侧背部种植肿瘤细胞，长至5mm X 5mm大小时开始注射（一般建模时间需要两周左右，具体将根据肿瘤细胞的生长速度而定）；重复注射2至4周，每三天注射一次。注射后每天测量并计算瘤体体积，绘制生长曲线。之后取肿瘤组织，进行切片染色、qPCR、WB等实验检测抑制效果。

二、系统给药 适应模型：循环系统（免疫系统）、作用于血流丰富的脏器（肝脏、心脏、肺脏、肾脏、脾脏）

操作指导：以免疫系统疾病模型为例

1）注射体积和计量
通过尾静脉注射，每次注射体积200μl；对于初次操作的人员，可用Balb/c小鼠练习尾静脉注射操作，注射灭菌后的PBS或者注射用生理盐水。

miRNA agomir推荐剂量：每次注射5~20nmol；miRNA antagomir推荐剂量：每次注射50~200nmol。

2）注射剂的配制
miRNA agomir和antagomir由于涉及多种化学修饰，要避免反复冻融。如果分装规格较大，第一次稀释后需要进行分装，分装剂量按照实验动物的数量来确定，尽量让解冻的试剂一次用完。

以10nmol agomir冻干粉一管为例，离心后直接加入200μl 灭菌PBS或注射用生理盐水进行稀释。

3）注射时间
针对急性模型（作用时间小于一周），建议单次高剂量注射；
针对慢性模型（作用时间超过一周），建议中低剂量多次给药，每周注射2~3次加强作用效果。

注： 以上数据来源于大量科研工作者的实验结果，由于miRNA本身丰度差异大，作用的部位不一，目前动物实验的miRNA agomir及antagomir注射剂量无法建立统一标准，建议科研人员根据我们的推荐剂量结合预实验的初步结果进行调整。

延伸阅读：

《相约2015NSFC》之疾病相关miRNA研究策略