Nature Biotechnology：CRISPR脱靶的全基因组图谱

　　

生物通报道：CRISPR-Cas是时下最热门的基因编辑工具。日前，麻省总医院（MGH）的研究团队开发了在基因组范围内检测CRISPR脱靶效应的全新方法，GUIDE-seq（Genome-wide Unbiased Indentification of DSBs Evaluated by Sequencing）。这一成果发表在十二月十六日的Nature Biotechnology杂志上。

“以往人们在检测CRISPR-Cas核酸酶诱导的脱靶DNA断裂时，往往事先假定脱靶位点与靶标位点相似。GUIDE-seq是首个不需要这样做的方法，而且它相当灵敏，”这项研究的资深作者，哈佛医学院的副教授J. Keith Joung说。“这对于评估CRISPR-Cas的临床安全性非常重要。”

CRISPR-Cas RNA引导性核酸酶（RGN）通过断开双链DNA来引入遗传学改变，RGN含有一个Cas核酸酶和一个与目标DNA序列互补的短RNA。去年Joung等人首次报告，当DNA片段与目标片段的差异在五个核苷酸以下，CRISPR-Cas RGN就会出现脱靶。这样的脱靶突变会导致包括癌症在内的副作用，鉴定并减少这些DSB是确保CRISPR临床安全性的基础。

研究人员利用一种短双链寡核苷酸来标记CRISPR-Cas诱导的脱靶断裂，测序这些标签所在的基因组区域，就能够确定脱靶突变的位置。研究表明，就算某个脱靶突变的出现频率低至0.1%，GUIDE-seq也能够检测得到。由于许多脱靶突变发生在与目标位点差异很大的地方，因此脱靶DSB的数量和位置是很难预测的。

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现有工具主要是通过分析目标序列来预测脱靶突变，研究人员将这些工具与GUIDE-seq进行了比较。研究显示，上述工具在预测已验证的脱靶位点时比GUIDE-seq差很多，还会错误检出实际上不被酶切的位点。此外，研究人员还对比了GUIDE-seq和ChIP-seq（检测蛋白与DNA的结合），结果证明ChIP-seq并不是鉴定 CRISPR-Cas脱靶DSB的可靠方法。

GUIDE-seq也可以用来鉴定普通细胞中的DSB热点区域，“之前有许多文章描述过人类细胞的基因组脆弱位点，”Joung说。“用GUIDE-seq鉴定这些位点，不需要事先添加药物来增强断裂。我们惊讶的发现，不同细胞系的DSB大多发生在不同的位置。我们的研究表明，GUIDE-seq可以成为在活细胞中研究和监控DNA修复的有用工具。”

Joung等人之前曾经发表文章指出，缩短引导RNA能够显著改善CRISPR-Cas的精确性，减少全基因组中的脱靶DSB。他们在这项新研究中用GUIDE-seq验证了这个方法的有效性。（相关报道：Nature子刊：巧解基因编辑脱靶问题）

Joung希望GUIDE-seq日后可以用来鉴定其他基因编辑工具诱导的脱靶断裂。他还认为，在未形成细胞系的细胞中检测脱靶效应是很重要的，这样的结果更贴近基因编辑工具在临床上的作用机制。

“GUIDE-seq是一个非常直观的方法，我们打算在不久的将来把分析测序数据的软件放到网站上，供非商业性质的研究人员使用，”Joung说，他已经为GUIDE-seq技术递交了专利申请。

 

生物通编辑：叶予

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GUIDE-seq enables genome-wide profiling of off-target cleavage by CRISPR-Cas nucleases