TUNEL分析试剂盒帮你探寻凋亡的秘密

DNA片段化是细胞凋亡的一个显著标志，而TUNEL分析是检测DNA片段化的一个常用技术。 本文介绍了目前市面上的一些TUNEL分析试剂盒，以及TUNEL分析时的一些难点，希望能够为你的凋亡检测提供帮助。

生物通报道：不论是正常发育还是疾病发展，细胞凋亡（或称为程序性细胞死亡）都是一个重要的过程，因此它也受到了研究者们的广泛关注。DNA片段化是细胞凋亡的一个显著标志，而TUNEL分析是检测DNA片段化的一个常用技术。

TUNEL分析的全名是脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）介导的缺口末端标记法，其原理是染色体DNA断裂时会产生大量的粘性3'-OH末端，生物素或荧光素标记的dUTP可在TdT的作用下掺入到DNA的3'-末端，随后被显色系统检测出来。

本文介绍了目前市面上的一些TUNEL分析试剂盒，以及TUNEL分析时的一些难点，希望能够为你的凋亡检测提供帮助。（延伸阅读：Nature细说凋亡细胞的解体）

样本类型和检测方法

TUNEL分析的检测方法取决于分子标签的特性。举例来说，对于标记有绿色或红色荧光分子的DNA来说，需要用到荧光计、显微镜或其他荧光检测设备。如果对象是悬浮细胞，还可以使用流式细胞仪。对于生物素标记的DNA而言，可通过链酶亲和素-辣根过氧化酶进行检测，这一系统产生的显色或发光信号需要用到光度计。

在决定分子标签和检测方法之前，你应当考虑到样本的类型，R&D Systems的产品经理Martin Ramsden说。市面上有许多针对不同样本进行优化的试剂盒，例如R&D Systems提供有针对固定细胞、包埋组织、冰冻组织、悬浮细胞和单层细胞的多种TUNEL试剂盒。

据EMD Millipore的产品经理Jun Ma介绍，该公司的TUNEL分析试剂盒可以检测组织或全细胞，组织样本的检测方法有过氧化物酶和荧光检测，而全细胞的检测方式有荧光检测和流式细胞分析。

EMD Millipore的TUNEL分析产品包括：可用于石蜡包埋组织、冰冻组织切片、细胞悬液和贴壁细胞的ApopTag® ISOL双荧光凋亡检测试剂盒；对悬浮细胞进行流式分析的Apo-Direct TUNEL分析试剂盒；以及ApopTag过氧化物酶原位凋亡检测试剂盒。

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荧光检测和显色检测

非放射性的TUNEL分析一般以荧光或显色检测为基础。例如，Promega公司的DeadEnd™ 荧光TUNEL分析系统，可检测细胞培养物和FFPE组织切片。这个产品还有一个显色版，主要针对体外培养的细胞，不过也能支持较厚的组织切片。

BioVision公司开发了一系列以荧光检测为基础的试剂盒，能够对悬浮细胞、单层细胞、包埋组织和冰冻组织进行凋亡检测。该公司的ApoBrdU™ 和ApoDIRECT™试剂盒可通过流式分析检测凋亡细胞，而ApoBrdU-IHC™通过双色免疫组化法（IHC）检测DNA片段化。对于表达GFP的细胞，该公司推荐ApoBrdU Red™试剂盒。据BioVision公司的技术专员Poulomi Acharya介绍，该产品可以实现目的基因（绿色）和DNA片段化（红色）的双色检测。立即索取相关产品资料

其它供应商也提供有多种以荧光检测为基础的试剂盒，例如Trevigen公司的TACS® TdT原位荧光试剂盒（R&D Systems也销售该试剂盒），这一产品可以帮助用户通过荧光显微镜检测固定、包埋或冰冻的组织样本。另外，Trevigen公司的FlowTACS®原位荧光试剂盒，既支持单层细胞的荧光显微镜检测，又可对悬浮细胞进行流式分析。

此外，Trevigen公司还为显色法检测提供了TACS-XL®试剂盒，该产品包括结合了生物素的BrdU抗体，以及链霉亲和素-辣根过氧化物酶。“生物素-链霉亲和素可以增强信号，将这一系统与抗体的特异性结合，能够实现精确的细胞标记和高信噪比，”Trevigen公司的市场经理Plamena Kirova说。如果你想用酶标仪对96孔板进行显色分析，那么Trevigen公司的TiterTACS®检测试剂盒将是个不错的选择。

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满足多样化的需求

罗氏开发了一系列原位细胞凋亡检测试剂盒，这些产品主打灵活性，可以满足研究者们在不同样本类型中进行凋亡检测的需求。“这些产品允许用户通过荧光显微镜、光学显微镜或FACS检测凋亡细胞，”罗氏的资深技术顾问David Guffey说。“可以支持石蜡包埋或冰冻的组织切片，或者盖玻片和载玻片上的凋亡细胞。”

有的TUNEL试剂盒还支持对凋亡细胞进行电镜检测。例如Trevigen公司的TACS-XL DAB原位凋亡检测试剂盒。该产品可将BrdU核苷酸插入DNA末端，然后通过生物素化的抗体和链酶亲和素偶联的标记物进行检测。这种标记物通常是辣根过氧化物酶，不过也可以偶联电镜可识别的胶体金。

此外，Trevigen公司还允许研究者们，针对自己的样本优化凋亡分析的步骤。不过，你也可以直接购买为特定组织类型而优化的试剂盒，比如针对心肌组织的CardioTACS™、针对神经组织的NeuroTACS™ II、针对肿瘤组织的TumorTACS™、针对皮肤组织的DermaTACS™和针对血管组织的VasoTACS™试剂盒。“这些试剂盒经过了阳离子系统的优化，能够实现对凋亡DNA末端的理想标记，将坏死细胞的干扰降到最低，”Kirova说。

TUNEL分析的难点

目前市面上的TUNEL分析试剂盒都经过了厂家的优化，不过研究者们在进行TUNEL检测时仍旧面临着一些难点。

首当其冲的问题是，TUNEL检测的假阳性。TUNEL分析所检测的DNA断裂，并非只有凋亡才能引起，细胞坏死时也会出现DNA断裂。“如果你只对细胞凋亡感兴趣，担心组织或细胞样本中的坏死引起过高的假阳性背景，那么可以选择更善于区分凋亡和坏死的TUNEL分析试剂盒，”Ma说。举例来说，EMD Millipore的ApopTag ISOL双荧光凋亡检测试剂盒只检测双链DNA断裂。“这些断裂与凋亡的关系更大，对于坏死细胞水平较高的疾病组织特别有用，”Ma说。

另一个问题是，如何在合适的时间点进行凋亡检测，Promega公司的产品专员Terry Riss说。“凋亡是一个快速变化的过程，许多现象转瞬即逝”为此，不少研究者会检测出现在不同时间点的凋亡标志物。“最常用的终点检测是caspase-3/7活性分析，它代表着凋亡的执行阶段。此外，对凋亡表型进行形态学观察，也是一个很好的直观方法，”Riss说。

最后一个难点在于，在分析固定化和通透化的组织时，要确保达到了合适的通透性。“组织样本通透性不足，是研究者们使用TUNEL分析试剂盒时常会遇到的一个问题，”Guffey说。目前绝大多数的TUNEL分析方案，是针对10-15µm的组织切片设计的。“如果组织切片的厚度超出这一范围，通透化的时间就应该相应的延长，”他解释道。“如果没有正确通透化，样本就可能无能呈现出凋亡的特征。”

在凋亡分析的发展历程中，出现于二十世纪九十年代的TUNEL技术并不算是个新成员。不过这一分析在今天依然受到大众的欢迎，这是因为TUNEL能够与其他细胞学技术很好的契合。

“使用TUNEL分析进行凋亡研究有一个好处，我们可以在同一个样本上检测细胞表面和细胞内的生物学指标，”Guffey说。“因为TUNEL分析的工作流程与免疫组化非常类似，二者能够很好的兼容。研究人员在TUNEL法标记细胞之后，还可以通过抗体检测其他的生物学指标。”

 

（Caitlin Smith撰写/叶予编译）