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蛋白质印迹手册1:膜的选择

【字体: www.ebiotrade.com 时间:2014年5月19日 来源:默克密理博

摘要:

  PVDF膜和NC膜作为Western印迹应用中最常用的两种类型的膜,各有什么特点?我们该如何选择?近四十年来,默克密理博一直是转印膜的领先供应商。它目前提供三种PVDF膜。这三种膜有何不同,分别适合哪些应用呢?详见本文。

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Part 1  膜的选择

印迹所使用的膜的类型可能影响下列因素:

• 蛋白质结合能力
• 是否需要用醇预湿
• 开展多次剥离(stripping)和再生检测(reprobing)实验的能力
• 蛋白质观察
• 长期印迹保存
• 信噪比

聚偏二氟乙烯(PVDF)和硝酸纤维素是Western印迹应用中最常用的两种类型的膜。

与硝酸纤维素膜相比,电转到PVDF膜上有许多优点。PVDF膜可提供更好的蛋白质截留率、物理强度和广泛的化学兼容性(Pluskal等,1986)。其中更高的机械强度和出色的耐化学性让PVDF膜成为免疫检测中各种染色应用和二次检测的理想选择。使用PVDF膜的另一个优点是,单块凝胶上的平行重复泳道可用于各种应用中,如考马斯蓝染色,接着切割条带进行N端测序,蛋白质水解/肽段分离/内部测序,以及免疫检测(Kurien等,2003)。市售的硝酸纤维素膜的典型结合能力是80 – 100 μg/cm2,而PVDF膜的结合能力是100 – 200 μg/cm2

在检测血清中人免疫缺陷病毒(HIV)时直接比较PVDF和硝酸纤维素膜,结果表明,PVDF膜有着更好的总体HIV抗原截留率,并且有助于改善提高抗体对糖基化包膜抗原的检测(Lauritzen和 Pluskal,1998)。硝酸纤维素膜和PVDF膜的特性比较详见表1。

表1. PVDF和硝酸纤维素膜特性及应用的比较。

特性/应用

硝酸纤维素

PVDF

物理强度

蛋白质结合能力

80 – 100 μg/cm2

100 – 300 μg/cm2

耐溶剂性

Western转移

总蛋白染料

胶体金

胶体金

丽春红

丽春红

氨基黑

氨基黑

印度墨汁

印度墨汁

Sypro® 印迹染料

考马斯蓝染料

检测

显色

显色

化学发光

化学发光

荧光

荧光

放射性

化学荧光

 

放射性

双印迹方法

快速免疫检测

Western再次杂交

Edman测序

氨基酸分析

SDS存在下的结合

膜上消化或质谱分析

直接MALDI-TOF MS分析

数据可存档

Immobilon® PVDF转印膜

默克密理博提供三种PVDF膜:

• Immobilon®-P膜(0.45 μm)是一种通用的基质,适用于一般的免疫印迹应用。
• Immobilon®-PSQ膜(0.2 μm)适用于蛋白质测序和低分子量蛋白的免疫印迹。它有着更高的蛋白质结合能力以及比0.45 μm膜更高的截留率。
• Immobilon®-FL膜(0.45 μm)是为荧光免疫检测而开发的。它在多种激发和发射波长范围内的荧光背景都极低。

Immobilon® 转印膜以卷膜和方片膜形式提供。预切好的膜与所有预制胶以及大部分市售的凝胶电泳系统兼容。Immobilon® 转印膜的性质详见表2。表3列出了与最常用的电泳系统相匹配的Immobilon® 预切膜的尺寸。表4列出了与现有的预制胶相匹配的Immobilon® 预切膜的尺寸。

表2. Immobilon® PVDF转印膜的性质和应用。

 

Immobilon®-P转印

Immobilon®-PSQ转印

Immobilon®-FL转印

描述

为结合从各种凝胶基质上转移的蛋白质而优化

均一的孔径结构带来分子量<20 kDa的蛋白质的出色结合

为荧光免疫检测应用而优化

组成

PVDF

PVDF

PVDF

孔径大小

0.45 μm

0.2 μm

0.45 μm

疏水性

疏水

疏水

疏水

应用

Western印迹

低分子量

Western印迹

结合分析

Western印迹

斑点/狭缝印迹

氨基酸分析

氨基酸分析

荧光免疫检测

N端蛋白测序

质谱分析

 

斑点/狭缝印迹

N端蛋白测序

 

糖蛋白观察

 

 

脂多糖分析

 

 

质谱分析

 

 

检测方法

显色

显色

荧光

化学荧光

荧光

显色

化学发光

化学荧光

化学荧光

放射性

化学发光

化学发光

 

放射性

 

蛋白质结合能力

胰岛素:160 μg/cm2

胰岛素:262 μg/cm2

胰岛素:155 μg/cm2

BSA215 μg/cm2

BSA340 μg/cm2

BSA205 μg/cm2

山羊IgG294 μg/cm2

山羊IgG448 μg/cm2

山羊IgG300 μg/cm2

兼容的可逆染料

透射法

透射法

透射法

丽春红

丽春红

丽春红

CPTS

CPTS

CPTS

甲苯胺蓝

甲苯胺蓝

Sypro 印迹染料

Sypro® 印迹染料

Sypro 印迹染料

 

兼容的不可逆染料

考马斯亮蓝染料

考马斯亮蓝染料

考马斯亮蓝染料

氨基黑

氨基黑

氨基黑

印度墨汁

印度墨汁

 

胶体金

胶体金

 

表3. Immobilon® PVDF预切转印膜和匹配的电泳系统。

表4. Immobilon® PVDF预切转印膜和匹配的预制胶。

(实际内容以《蛋白质印迹手册》印刷版为准,如有错漏,敬请谅解)

立即索取印刷版《蛋白质印迹手册》

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