PLOS：观察艾滋病毒从细胞中出芽

　　

生物通报道：最近，美国犹他大学的研究人员发明出一种方法，来观察新形成的AIDS病毒颗粒从受感染的人类细胞显露或“出芽”，而不会干扰这个过程。利用这种方法，研究人员发现，一种称为ALIX的蛋白质介入了病毒复制的最后阶段，而不是以前认为的较早阶段。

相关研究结果发表在2014年5月16日的《公共科学图书馆期刊》（PLOS ONE），本文资深作者、物理与天文学助理教授、病毒学家Saveez Saffarian指出：“我们每次观察一个细胞，使用数码相机和特殊的显微镜，拍摄出芽过程中的视频和照片。”

“我们第一次看到，ALIX被招募到HIV的出芽过程中。大家都知道ALIX参与HIV的出芽过程，但是没有人能将ALIX到该过程的招募可视化。”

Saffarian称，这一发现属于基础科学，对艾滋病患者没有直接的临床意义，因为ALIX参与了太多的重要功能（如细胞分裂），因此不能作为新药物的一个可能靶标。

他补充说：“我们非常了解这些帮助HIV脱离细胞的蛋白，但是我们不知道它们是如何团结在一起帮助病毒脱离的，在未来的10到20年，我们将对这一机制有更多了解。它将会是一个药物靶点吗？将是用于以后治疗或生物技术行业的生物化学的一部分么？现在我不能给出答案。但是如果不是因为我们的好奇心，就不会有今天的这项新技术。”

犹他大学医学院生物化学系主任、HIV出芽专家Wes Sundquist教授表示：“这项新研究工作非常的出色，对于我们这些研究HIV组装机制的人来说，这是真正的兴趣。”

这项工作是由美国国家科学基金会资助。第一作者为犹他大学物理学博士Pei-I Ku，共同作者还包括：物理学和天文学博士后Mourad Bendjennat、技术员Jeff Ballew和博士后Michael Landesman。

观察HIV出芽
多年来，研究人员利用生化方法，包括在实验室玻璃器皿中收集上百万种病毒，进行不同的分析，揭示构成病毒的蛋白质，例如利用结合到某些蛋白质上的抗体，以及使第一个蛋白发出荧光的其他蛋白质。

Saffarian称：“你不能同时在一种病毒内进行这些分析。因为你没有看到相似病毒之间的差异。你没有看到各种蛋白质来来往往帮助病毒脱离细胞的时机。”

其他一些方法，当HIV颗粒在细胞上出现时，将其冷冻或固定在细胞上，并用电子显微镜拍摄这些病毒复制的定格图像。Saffarian也使用称为“全内反射荧光显微镜”的技术，这种技术已被用来观察细胞中的动态过程。

以前，有研究人员使用这种方法，实现了HIV和一种相似的马病毒（EIAV）的出芽成像。但是，Saffarian称，他们的研究并没有表明ALIX参与HIV出芽，并且有缺陷，因为它们错误地指出，ALIX蛋白介入EIAV出芽过程的较早阶段，在HIV出芽过程中也同样。

Ku、Saffarian及其同事将这种显微镜技术与改进的方法结合，在克隆细胞中，通过遗传学手段将一种绿色荧光标签结合到ALIX蛋白，因此他们可以看到蛋白质，而无需伤害其正常的结构。研究人员尝试了许多所谓的“接头序列（linker）”，找到了一个接头序列可使他们看到介入HIV出芽的ALIX蛋白，而不会干扰这个过程。

他补充道，无论是显微镜技术，还是绿色荧光标记蛋白都不是新的，但是这项研究的创新之处在于，使用了许多不同种类的连接序列，将这些荧光蛋白结合到ALIX，以找到可让ALIX蛋白正常运转的那一个连接序列。

Saffarian称，早期研究表明ALIX蛋白介入出芽过程的早期阶段，但问题是，这些研究只使用了一个连接序列，从而削弱了ALIX的正常功能。

观察蛋白质形成HIV
当HIV在人类细胞内复制时，一个称为Gag的蛋白构成其大部分新颗粒——每个HIV颗粒中有4000个Gag蛋白拷贝，虽然其他一组蛋白也参与了这个过程，包括ALIX，这代表“alg-2互作蛋白x”。Saffarian研究小组所使用的病毒样颗粒，是被剥夺基因蓝图或基因组的HIV颗粒，所以它们在实验室不会造成感染风险。并且，病毒样颗粒能够保持与传染性HIV相同的几何形状和萌芽过程。

在病毒出芽期间，Gag蛋白在细胞膜里面组装——在后期阶段与ALIX一起，形成一个新的HIV颗粒并使其脱离细胞，艾滋病患者中的AIDS可通过这个过程，从一个细胞传播到另一个细胞。

为了观察出芽过程，Ku、Saffarian和同事们把包含病毒颗粒的人HELA细胞放入培养皿的少量液体培养基中，将其放置在显微镜下，这是一个保持在体温状态的玻璃室，因此细胞能够存活超过48小时。一束固态蓝色激光瞄准样品，使绿色标记的ALIX蛋白和红色标签Gag蛋白发光或发荧光，以便于它们组装成病毒颗粒时可被观察到。

Saffarian指出：“利用红色标记的Gag蛋白和绿色标签的ALIX蛋白质，我们能够看到ALIX出现在病毒颗粒组装的后期，大约100个ALIX蛋白质与大约4000个Gag分子融合，并组装成一个新的HIV颗粒。然后，ALIX引进两种其他蛋白质，它们可在出芽病毒颗粒浮现时，将其从细胞上切断。在这之前，还没有人确定ALIX在新病毒颗粒挤压断离期间所处的位置。”

研究人员每次观察来自一个细胞的病毒颗粒出芽：通常其中有100个在两小时内出现。Saffarian称，大多数ALIX蛋白质在HIV组装完成后离开，并返回到细胞内液中。

他认为，ALIX直到HIV出芽的晚期阶段才参与其中，这说明病毒中存在一种以前未被确认的机制，这一机制可调节ALIX和其它蛋白在组装新HIV颗粒过程中的时机。

Saffarian指出：“我们发现，帮助病毒释放的细胞成分，实际上到达的时间要以比基于生化数据预测的更为复杂。这项研究结果非常有前景，因为它揭示了细胞成分招募到HIV出芽部位的一种新调控机制，并为未来HIV出芽机制的研究打开了大门。”

（生物通：王英）

延伸阅读：两篇Nature：抗击艾滋病病毒的“万能”钥匙

生物通推荐原文摘要：
ALIX Is Recruited Temporarily into HIV-1 Budding Sites at the End of Gag Assembly
Abstract：Polymerization of Gag on the inner leaflet of the plasma membrane drives the assembly of Human Immunodeficiency Virus 1 (HIV-1). Gag recruits components of the endosomal sorting complexes required for transport (ESCRT) to facilitate membrane fission and virion release. ESCRT assembly is initiated by recruitment of ALIX and TSG101/ESCRT-I, which bind directly to the viral Gag protein and then recruit the downstream ESCRT-III and VPS4 factors to complete the budding process. In contrast to previous models, we show that ALIX is recruited transiently at the end of Gag assembly, and that most ALIX molecules are recycled into the cytosol as the virus buds, although a subset remains within the virion. Our experiments imply that ALIX is recruited to the neck of the assembling virion and is mostly recycled after virion release.