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蛋白质印迹手册5:WB之蛋白转移

【字体: www.ebiotrade.com 时间:2014年5月29日 来源:默克密理博

摘要:

  电泳洗脱,或电泳转印是迄今为止使用最广泛的转印方法。与扩散或真空转印相比,主要优点是速度和转移完全。两种常用的电泳转印技术是槽转印和半干转印。它们都基于相同的原理,只是容纳凝胶/膜堆积层所用的机械装置和电场的施加不同。

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蛋白质从凝胶转移到膜上

蛋白质从凝胶转移到膜上,同时维持其相对位置和分辨率的过程被称为转印。转印可通过三种不同的方法来实现:

简单扩散(Kurien和Scofield,1997)是在凝胶上依次放置膜、一叠干滤纸,并在滤纸上放上重物以促进扩散过程而实现的(Kurien和Scofield,2003)。这种方法可将一块凝胶上的蛋白质转移到多块膜上(Kurien和Scofield,1997),获得同一块凝胶的几个印迹。扩散方法的主要缺点是转移不是定量的,与电泳转印相比只能转移25-50%的蛋白质(Chen和Chang,2001)。

真空辅助的溶剂流(Peferoen等,1982)利用泵的抽吸能力,将凝胶上分离的蛋白质吸到膜上。高分子量和低分子量的蛋白质都可用这种方法转移;不过,分子量低于20 kDa的蛋白质需要使用较小的孔径(0.2 μm),因为它们不易被0.45 μm的膜吸附(Kurien,2003)。蛋白质从聚丙烯酰胺凝胶上的真空转印不大常见,主要用于核酸从琼脂糖凝胶上的转移。

电泳洗脱,或电泳转印(Towbin等,1979)是迄今为止使用最广泛的转印方法。与扩散或真空转印相比,主要优点是速度和转移完全(Kurien等,2003)。

电泳转印技术

两种常用的电泳转印技术是槽转印和半干转印。它们都基于相同的原理,只是容纳凝胶/膜堆积层所用的机械装置和电场的施加不同。

槽转印(图6)是一种传统的技术,其中凝胶/膜堆积层被完全浸湿在缓冲液槽中,并施加电流。这是一种有效但缓慢的技术,使用大量缓冲液。槽转印系统一般在恒定电压下运行;转移过程中缓冲液的混合让电流保持相对恒定。

图6. 槽(湿式)转印系统。

半干转印(图7)以一叠经缓冲液浸湿的滤纸取代了缓冲液槽。由于板电极直接接触滤纸,通过凝胶的场强最大化,利于快速、高效的转移。这种技术同样有效,且比槽转印快得多(15-45分钟)。大多数半干转印方法使用不止一种缓冲液系统,来实现大蛋白和小蛋白的高效转移。不过,半干转印系统有着较低的缓冲能力,因此不适合长时间转印。半干转印是大的2-D凝胶转印的首选方法。半干转印仪通常在恒定电流下运行;在转移过程中电压会增加。

对于半干转印系统,滤纸和膜必须切成与凝胶同样大小,这样电流才被迫穿过凝胶。否则,电流会通过凝胶周围的重叠滤纸而短路。在两种类型的转印系统中,需要格外小心,以避免在滤纸、凝胶和膜之间引入气泡。气泡阻碍转移,引起转印膜上的“秃斑”(即无转移区域)。

图7. 半干转印系统。

(实际内容以《蛋白质印迹手册》印刷版为准,如有错漏,敬请谅解)

立即索取印刷版《蛋白质印迹手册》

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