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蛋白质印迹手册6:转印缓冲液

【字体: www.ebiotrade.com 时间:2014年5月30日 来源:默克密理博

摘要:

  转印缓冲液提供了电极之间的电连续性,必须是导电的。它还提供了一个化学环境,能维持蛋白质的溶解度,又不妨碍转移过程中蛋白质吸附到膜上。对于大多数蛋白质样品,常见配方可实现这些功能。至于添加到缓冲液中的甲醇,它有什么功能呢?请看本文。

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转印缓冲液

转印缓冲液提供了电极之间的电连续性,必须是导电的。它还提供了一个化学环境,能维持蛋白质的溶解度,又不妨碍转移过程中蛋白质吸附到膜上。对于大多数蛋白质样品,常见配方可实现这些功能。大部分缓冲液在转移过程中发生焦耳加热。基于这个原因,许多槽转印系统都配有内置的冷却管。转印槽还可以放在冷室内,而缓冲液可以在使用前经过预冷。在半干转印系统中,电极板还可作为散热片。但它们的散热能力有限,因此半干系统一般不用于长时间转印。

传统的转印缓冲液包含缓冲系统和甲醇。Towbin缓冲液(1979),Tris甘氨酸缓冲液,常用于槽转印系统中。这种缓冲液的pH值为8.3,比大多数蛋白的等电点(pI)要高。在凝胶上分离的蛋白质带负电荷,向阳极迁移。由于槽内的缓冲液是混合的,故转移过程中的离子分布保持相对恒定。

半干系统可利用单一或三重缓冲液系统(Kyhse-Anderson定义,1984)来运行。使用三重缓冲液,是因为转移是个等速电泳的过程,其中蛋白质在领先离子和尾随离子之间移动(Schafer-Nielsen等,1980)。在某些情况下,三重缓冲液系统可实现更好的定量转移。这三重缓冲液分别为:

• 阳极缓冲液I:0.3 M Tris,pH 10.4
• 阳极缓冲液II:25 mM Tris,pH 10.4
• 阴极缓冲液:25 mM Tris和40 mM ε-氨基己酸,pH 9.4

阳极缓冲液I中和阳极板表面产生的过量质子。阳极缓冲液II与阳极缓冲液I的pH值相同,但Tris浓度低至25 mM。阴极缓冲液包含ε-氨基己酸,作为转移过程中的尾随离子,并在阴极缓冲液中逐渐耗尽,因为它穿过凝胶向阳极移动。对于半干系统中采用单缓冲液,请查询制造商的建议。

尽管上面定义的缓冲液系统适用于大多数蛋白转印,但文献中包含许多变化,适用于不同的应用。最明显的变化之一是在蛋白测序应用中,建议使用10 mM CAPS缓冲液(pH 11)(Matsudaira,1987)。Towbin缓冲液中使用以及凝胶电泳缓冲液中残留的甘氨酸导致采用Edman原理的自动蛋白测序仪中出现高背景。通过改变转印缓冲液的配方,这种假象明显减少。缓冲液强度及组成的任何修改应小心进行,以确保转印装置不会过热。

转印缓冲液甲醇的功能

添加到转印缓冲液中的甲醇有两个主要功能:

• 稳定凝胶的尺寸。
• 从蛋白质分子上解离出复合的SDS。

聚丙烯酰胺是一种水凝胶,具有吸收水分的能力。在纯水中,各个维度的凝胶尺寸都有相当量的增加。溶胀度也取决于凝胶中所使用的丙烯酰胺的浓度。高浓度的凝胶比低浓度的凝胶溶胀得更多。梯度胶会明显突出这种影响,其底部高浓度的区域比顶部溶胀得更多。开始时是矩形的凝胶可能会变成梯形。添加到转印缓冲液中的甲醇能最大限度地减少凝胶溶胀,而转印操作通常也包括一个平衡步骤,以达到凝胶尺寸的稳定性。当甲醇浓度为10%-20%时,尺寸稳定性可相当快速地实现。当甲醇浓度较低时,平衡需要更长的时间才能实现。如果在转移过程中发生尺寸改变,蛋白质的分辨可能会损失。对于在甲醇中溶解度有限的高分子量蛋白质,甲醇的减低会导致蛋白转移效率明显提高,但这可能需要更长的平衡时间来确保尺寸稳定性。

甲醇的第二个功能对于蛋白质从包含SDS的凝胶上转移很关键。甲醇可帮助从蛋白质分子上解离所复合的SDS(Mozdzanowski和Speicher,1992)。尽管SDS对凝胶上单个蛋白质的分辨很必要,但是对于有效印迹却是极为不利的。首先,SDS的结合给蛋白质分子带来高的负电荷密度,导致蛋白质分子非常快速地穿过膜,减少在孔结构内的停留,从而降低分子间相互作用的机会。其次,通过包被蛋白质分子,SDS限制蛋白质与PVDF进行分子接触的能力。这些影响随着蛋白质的分子量降低而增加。甲醇通过解离SDS,并提高蛋白质分子与膜结合的可能性,从而减少这两方面的影响。

(实际内容以《蛋白质印迹手册》印刷版为准,如有错漏,敬请谅解)

立即索取印刷版《蛋白质印迹手册》

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