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蛋白质印迹手册13:蛋白质鉴定(二)

【字体: www.ebiotrade.com 时间:2014年6月30日 来源:默克密理博

摘要:

  质谱(MS)是一种用于鉴定印迹上蛋白质的分析方法。用MS兼容的染料(考马斯亮蓝、氨基黑或Sypro®染料)对PVDF膜上的蛋白质进行染色后,目的条带被剪下来,并进行胰蛋白酶消化。所产生的肽片段可用质谱法分析(Gharahdaghi等,1996;Bienvenut等,1999;Bunai等,2003)。

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质谱分析

利用Immobilon® PVDF转印膜进行质谱分析

质谱(MS)是一种用于鉴定印迹上蛋白质的分析方法。用MS兼容的染料(考马斯亮蓝、氨基黑或Sypro®染料)对PVDF膜上的蛋白质进行染色后,目的条带被剪下来,并进行胰蛋白酶消化。所产生的肽片段可用质谱法分析(Gharahdaghi等,1996;Bienvenut等,1999;Bunai等,2003)。图17显示了一张MALDI-TOF图谱,其中膜上消化的牛蛋白被成功鉴定为过氧化氢酶。

另一个要考虑的方法是直接在转印的Immobilon® PVDF转印膜上进行蛋白质谱分析。这种方法通常适用于2-D凝胶分离的蛋白质。通过平行处理,凝胶上的所有蛋白质同时被水解消化,并电转到Immobilon® PVDF转印膜上,随后经过扫描,以查看肽段是否存在(Binz等,1999;Bienvenut等,1999;Bienvenut等,2003)。或者,采用另一种被称为“化学印刷”的方法(Wallace等,2001;Gooley等,1998),首先将双向分离的蛋白转移至PVDF膜上并观察,然后直接在斑点上分配极少量的胰蛋白酶进行消化(Sloane等,2002)。在这两种方法中,膜都会被喷上基质,并通过MALDI-TOF MS直接扫描。通过肽质量指纹图谱分析来鉴定蛋白质。图18显示了2-D分离后的人血浆蛋白转移到Immobilon®-PSQ转印膜上,并获得两个MALDI-TOF图谱,以鉴定膜固定化的蛋白质。

图17. 肝脏蛋白的考马斯亮蓝染色印迹中一条带的MALDI-TOF图谱,利用操作5.1。膜上蛋白质消化,第57页(Bienvenut等,1999)。此蛋白质被鉴定为牛过氧化氢酶,有着6.4e+06的MOWSE分数和34% 覆盖度。数据在Bruker® Autoflex™质谱仪上获得。搜索是利用Protein Prospector进行的。

图18. 人血浆通过双向电泳分离,并转移到(左)Immobilon®-PSQ转印膜和(右)MALDI-TOF,直接收集自胰蛋白酶消化蛋白的膜表面。人血浆通过双向电泳分离,电转到Immobilon®-PSQ转印膜上,并粘附到MALDI靶板上。胞内胰蛋白酶的消化在膜表面直接开展。消化需要纳升级的酶,并利用ChIP™通过按需压电喷墨装置微喷在膜表面上(Proteome Systems和岛津公司)。由此产生的肽段通过AXIMA™-CFR(岛津公司)来分析。MALDI-TOF MS并利用肽质量指纹图谱鉴定。肽段直接在膜表面分析,其中MALDI基质在消化前被微喷在消化蛋白的上面。数据由J.L. Duff、F.G. Hopwood、C.J. Hill、A.A. Gooley博士友情提供(Proteome Systems,澳大利亚悉尼)。

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