蛋白质印迹手册12:影响免疫检测的因素(下)[创新技巧]

【字体: 时间:2014年06月27日 来源:默克密理博

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  影响免疫检测的因素有很多,包括缓冲液、封闭、抗体、清洗、检测底物等等。了解下列章节中提出的有关免疫检测的概念,将有助于优化特定样品的操作。

了解下列章节中提出的有关免疫检测的概念,将有助于优化特定样品的操作。

  • 双印迹

在Western印迹中避免非特异结合的一种新方法是由法国国家反兴奋剂实验室的Françoise Lasne博士开发的(Lasne,2001;Lasne,2003)。在研究重组人促红细胞生成素(EPO)时,Lasne博士发现重组和天然的EPO有着不同的等电点(pI)。重组EPO的pI为4.42-5.11,而天然EPO的pI偏酸性,为3.92-4.42。然而,在转印尿液样品时,二抗的超高非特异结合(NSB)让人难以区分重组和天然EPO。为了避免NSB,Lasne博士使用了“双印迹”。在一抗与印迹蛋白结合后,抗体在酸性条件下被转移到第二张Immobilon®-P膜。一抗从相应的抗原上释放,并通过中间体转移到第二张(双印迹)膜上。当双印迹膜与二抗杂交时,不存在其他的蛋白非特异结合,从而避免了背景问题。

“双印迹”也被用于转甲状腺素蛋白的检测,是检测低浓度的血清或尿液蛋白的有用方法。

  • 检测底物

现代的免疫检测方法是基于酶连检测,利用与酶共价结合的二抗,如辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酶(AP)。结合在二抗上的酶催化特异底物的降解,产生信号。通常使用三种类型的底物:显色、化学发光和化学荧光,以及用荧光基团标记的二抗来检测。Immobilon® PVDF膜经过检测,可与所有市售的化学和化学发光底物兼容。

显色检测

显色检测(图14)利用结合的酶来催化反应,使得不溶性的有色沉淀物沉积,例如,不溶的蓝色化合物通过5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸(BCIP)和氮蓝四唑盐(NBT)的相互作用获得的(Leary等,1983)。这种技术很容易开展,不需要特殊的设备。不过,以下应牢记:

• 显色检测的灵敏度通常至少比化学发光试剂低一个数量级。
• 沉淀物的产生可能干扰酶活并限制灵敏度。
• 沉淀物难以从膜上剥离,限制印迹再次用于其他蛋白质的检测。

图14. 利用显色底物BCIP/NBT(KPL)对人血清中的转铁蛋白进行免疫检测。从左到右,5 μL人血清稀释物1:1,000、1:5,000、1:25,000、1:125,000。电转的蛋白与山羊抗人转铁蛋白(1:10,000稀释度)和AP结合的兔抗山羊IgG(1:30,000稀释度)杂交。


化学发光检测

化学发光检测利用结合的酶来催化反应,使可见光产生。一些化学发光的系统是基于过氧化物的形成,通过辣根过氧化物酶;其他系统利用1,2-二氧杂环丁烷和碱性磷酸酶(Cortese,2002)。这种技术有着显色检测的速度和安全性,且灵敏度水平与放射性检测相当。检测可通过曝光到X射线胶片来实现,或直接在与化学发光兼容的数字成像系统上获取图像,它通常带有高冷却型CCD照相机,以避免电子噪音。化学发光底物可实现再次杂交。

目前有多种化学发光底物,为研究人员提供了不同的检测灵敏度。传统或低灵敏度的底物实现了皮克水平的蛋白检测。尽管这些底物适合常规应用,但它们无法检测低丰度蛋白。新的高灵敏度底物,如Luminata™ HRP底物,实现了飞克水平的蛋白观察。不过,在使用这些强大的底物时,往往需要优化一抗和二抗的浓度(图13,第29页)。从低灵敏度底物转换到高灵敏度底物(如Luminata™ Forte试剂)时,建议提高抗体稀释度,以避免背景过高和非特异条带的出现。

ECL免疫检测的试剂可利用对-碘苯酚(PIP)和鲁米诺(luminol)来制备(Hengen,1997)。PIP作为过氧化物酶对鲁米诺活性的辅助因子,是增强可见光反应所必需的。在苯酚增强剂与HRP共同使用时,光水平约提高100倍(Van Dyke和Van Dyke,1990)。这些自制的试剂被大量引用,产生出色的结果,但最高纯度的鲁米诺和PIP是关键(Hengen,1997)。

荧光检测

荧光检测采用与荧光基团结合的抗体或荧光底物,后者在酶活性的位点发出荧光(化学荧光)。这种方法的一个优点在于,荧光信号在长时间内保持稳定,印迹可保存并再次照相。此外,广泛的荧光基团让您能够同时检测单个样品中的多个目标蛋白(多重检测)。直到最近,Western印迹中的荧光检测仍受到大部分转印膜高荧光背景的限制。与其他转印膜相比,Immobilon®-FL转印膜在广泛的激发/发射波长下表现出低的背景荧光(图15)。这种膜特别适合涉及到荧光免疫检测的应用,包括化学荧光底物和多重分析(图16)。此外,Immobilon®-FL膜也可用于传统的化学发光或显色检测。

图15. 负片影像显示各种印迹膜上人血清中转铁蛋白的荧光检测。血清稀释度为:1:4,000、1:8,000、1:16,000、1:32,000、1:64,000。

图16. 大肠杆菌细胞裂解液中过表达GST蛋白(带cMyc或HA标签)连续稀释物的Western印迹。(A) cMyc标签以一抗以及Qdot® 705(伪蓝色)抗小鼠结合物检测;(B) GST以Qdot 565(绿色)抗GST结合物检测;(C) HA标签以一抗以及Qdot® 605(红色)抗小鼠结合物检测;(D) 印迹与三种抗体的组合杂交(多重分析)。印迹在柯达成像仪上扫描。数据由Quantum Dot公司提供。

  • 再次杂交Immobilon® PVDF转印膜

通过从印迹上剥离第一个抗体,并与另一个孵育,单个印迹能够依次与多个抗体进行分析。这对于共定位实验和方法优化或样品量有限时特别有用。

剥离过程破坏抗原抗体的键,将抗体溶解在周围的缓冲液中。这通常是通过去污剂和加热的组合或暴露在低pH下来实现的。这两种方法都不能去除显色检测系统所产生的有色沉淀物(如BCIP、4CN、DAB和TMB)。不过,仍然能用特异针对另一种目标蛋白的抗体来分析印迹。

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