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蛋白质印迹手册8:开发一种新的转印操作

【字体: www.ebiotrade.com 时间:2014年6月6日 来源:默克密理博

摘要:

  尽管上一节提到缓冲液和转印条件的选择可能非常复杂,但Towbin等定义的槽转印系统(1979)和由Kyhse-Anderson定义的半干转印系统(1984)能适用于大部分的蛋白质样品。这两者都代表了出色的起点。不过,假如它们的确并非最适合于某个特定蛋白质,那么可调整转印条件,以配合蛋白质的生化特性。

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开发一种新的转印操作

尽管上一节提到缓冲液和转印条件的选择可能非常复杂,但Towbin等定义的槽转印系统(1979)和由Kyhse-Anderson定义的半干转印系统(1984)能适用于大部分的蛋白质样品。这两者都代表了出色的起点。不过,假如它们的确并非最适合于某个特定蛋白质,那么可调整转印条件,以配合蛋白质的生化特性。Otter等(1987)介绍了一种有趣的优化策略,适合分子量在8,000至>400,000 kDa范围内的蛋白质的有效转移。转印缓冲液可添加0.01% SDS,以维持高分子量蛋白质的溶解度,以及20%甲醇,以增强吸附。电场可以两个阶段施加。转印的最初一小时是以低电流密度,以减慢低分子量蛋白质的迁移速率,增加它们在膜上的停留时间。之后以高电流密度,以洗脱高分子量的蛋白质。

在开发一种新的转印操作或处理一种新的样品类型时,凝胶应被染色,以验证所有蛋白质是否从凝胶上彻底洗脱。强烈建议在每块凝胶上点上一道预染marker,以监控转印效率。一些蛋白质在标准转印缓冲液中的溶解度有限,需要修改缓冲液试剂,以防止沉淀。另外一些蛋白质,如组蛋白和核糖体蛋白,在标准转印缓冲液中带正电荷,将向阴极迁移。在凝胶的阴极端放上一张Immobilon®-P膜,可实现这些蛋白质的成功转印。转印后的膜染色也很有用,可确保目标蛋白在印迹上。详见下面的“蛋白质观察”,了解能与后续的免疫检测兼容的染料信息。

另一个监控蛋白质转移的方法是在电转前对SDS-PAGE凝胶染色(Thompson和Larson,1992)。在这种方法中,凝胶在电泳后,或电泳过程中用考马斯亮蓝染色。免疫检测过程中的转移蛋白仍保持染色状态,从而为蛋白定位和大小确定提供一套背景marker(Thompson和Larson,1992)。

准备蛋白质鉴定的膜

对于染色和免疫检测

PVDF膜应用去离子水清洗,以去除任何凝胶碎片。转印膜随后可与封闭液一起孵育。

对于通过透照法的快速免疫检测和观察

在转印完成后,PVDF膜应彻底干燥,才能继续染色或进行免疫检测。干燥增强了蛋白质与PVDF聚合物的吸附,有助于减少后续分析过程中的解吸附。随着转印膜变干,它变得不透明。这种光学变化是一种表面现象,会掩盖孔深处水的保留。转印膜应按照建议的时间干燥,以确保所有液体从膜的孔结构内蒸发。

保存

在蛋白质转移到膜上之后,PVDF膜可以干燥保存很长一段时间,对膜或蛋白质无不良影响(4 °C最多两周;–20 °C最多两个月;–70 °C可保存更长时间)。然而,一旦在不可控的环境下长期保存,一些蛋白质可能对化学变化(如氧化、脱酰胺化、水解)敏感。建议在低温下长期保存。在进一步分析之前,干燥的膜必须在100%甲醇中浸湿。

(实际内容以《蛋白质印迹手册》印刷版为准,如有错漏,敬请谅解)

立即索取印刷版《蛋白质印迹手册》

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