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蛋白质印迹手册7:影响转印的因素

【字体: www.ebiotrade.com 时间:2014年6月5日 来源:默克密理博

摘要:

  影响蛋白质成功转移的因素有哪些?本文提到了四点:SDS的存在、电流和转印时间、转印缓冲液的pH值,以及平衡时间。

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SDS的存在

一些研究表明,在SDS-PAGE凝胶的背景下,蛋白质与SDS分子结合,因此不能有效地与转印膜结合。具体来说,在两小时内监控BSA在标准槽转印系统中的转移,数据表明,在单个蛋白条带中,分子分成多批从凝胶上转移(图8,第20页)。在最初60分钟内,约90%的BSA从凝胶上洗脱,在之后60分钟内还有7%。在最初15分钟内,部分洗脱的BSA被Immobilon®-P转印膜吸附,而剩余的穿过,被Immobilon®-PSQ转印膜吸附。而15分钟后洗脱的BSA几乎全被Immobilon®-P转印膜吸附。

图8. BSA的电转移。25 pmol 125I标记的BSA在10-20%的梯度胶上通过SDS-PAGE来分辨。平衡后5分钟,在槽转印系统中将BSA转移到Immobilon®-P转印膜,并用Immobilon®-PSQ转印膜来备份,利用25 mM Tris、192 mM甘氨酸和10%甲醇作为转印缓冲液。系统以8V/cm极间距离运行。在15、30、60和120分钟,取出凝胶/膜转印夹。切下BSA条带并计算。

最简单的解释是与高水平残留SDS结合的BSA从凝胶上快速洗脱,无法被Immobilon®-P转印膜所吸附。较慢洗脱的BSA能够被Immobilon®-P转印膜所吸附。

尽管去除凝胶上的SDS通常被认为是常规印迹的最好方法,但也有一些情况,说明在转印缓冲液中添加少量SDS也是值得考虑的。一种情况是待转移的蛋白质在缺乏SDS时溶解度很低。与细胞膜相关联或不可缺少的蛋白质可能是非常疏水的,当SDS被去除后,在聚丙烯酰胺中会沉淀。高分子量蛋白质也在缺乏SDS时表现出溶解度的问题,特别是当暴露在样品缓冲液的变性条件以及转印缓冲液所使用的甲醇下。转印缓冲液中补充SDS可帮助维持足够的溶解度,以便允许从凝胶上洗脱(如Towbin和Gordon,1984;Otter等,1987;Bolt和Mahoney,1997)。转印缓冲液中的SDS浓度不应超过0.05%,且应有足够的平衡时间,以去除凝胶上过量的SDS。

改善高分子量蛋白质的转印效率的其他方法包括延长转印时间,最多21个小时(Erickson等,1982),或使用包含SDS和尿素的复合琼脂糖聚丙烯酰胺凝胶(Elkon等,1984)。

电流和转印时间

适当的电流和转印时间对成功的转印至关重要。电流过低和/或时间不足将导致转印不彻底。相反,如果电流过高,蛋白质分子可能太快穿过膜而来不及被吸附。这对于较小的蛋白质来说可能是个值得注意的问题。通常,转印系统都会附带制造商关于电流和转印时间的建议,它们应被作为参考指引。

优化条件可能仍然需要,这取决于丙烯酰胺的比例、缓冲液组分,以及感兴趣蛋白质的分子量。一般来说,长的转印时间最适合槽转印系统,它通常需要冷却装置和转印缓冲液的内部循环。然而,对于半干式转印,延长转印时间可能导致缓冲液耗尽、过热和凝胶变干。如果太干,装置可能被电极板之间的电弧损坏。

转印缓冲液的pH值

转印缓冲液的pH值是另一个重要的因素。如果蛋白质的等电点与缓冲液的pH值相同,则转移不会发生。为了解决这一问题,可采用较高pH值的缓冲液(如CAPS)或较低pH值的缓冲液(如乙酸溶液)。

平衡时间

在蛋白质转印的早年(70年代末期,80年代初期),大部分操作要求在转印前平衡凝胶30分钟。5英寸标准凝胶,或一边长度超过5英寸,以及最小厚度>1 mm的凝胶需要延长平衡时间,来稳定凝胶的大小。随着迷你凝胶逐渐普及,平衡时间也缩短,因为水和甲醇需要平衡的体积减少了。

标准的迷你凝胶可在5-10分钟内达到尺寸的平衡,但SDS解离的动力学要慢得多,因此对于大部分迷你凝胶,建议平衡时间至少达到15分钟。

注意:对于包含小肽的样品,在没有电流动力的情况下,也可发生肽段的快速迁移。在这种情况下,凝胶在转印缓冲液中的平衡应限制在10分钟以内。

在SDS-PAGE系统中,电泳缓冲液中添加了SDS。这种SDS集中在阴极槽内,电泳时跟着溴酚蓝示踪染料。由于大部分凝胶的运行是直到示踪染料到达凝胶底部,此时所有过量的SDS仍残留在凝胶中,并被带入转印操作。如果转印前不允许SDS扩散到凝胶外,那么它将干扰蛋白质吸附。平衡时间可延长至30分钟,且应使用足够的缓冲液,将SDS稀释到最低水平。

平衡时间对BSA电转移的影响如图9所示。在这项研究中,放射性标记的BSA通过SDS-PAGE来分辨,而凝胶在转印缓冲液中的平衡时间在0至30分钟。蛋白质被转移到Immobilon®-P转印膜上,后面有一块备用的Immobilon®-PSQ转印膜,以吸收Immobilon®-P转印膜未截留的BSA。在转印过程结束时,凝胶、主要印迹(Immobilon®-P转印膜)和备份印迹(Immobilon®-PSQ转印膜)上的BSA被定量。当平衡时间延长至30分钟时,截留率提高到90%。研究发现其他蛋白质的表现类似。

图9. 平衡时间对BSA电转移到Immobilon®-P转印膜的影响。125I标记的BSA在10-20%的梯度胶上通过SDS-PAGE来分辨。在指定的平衡时间后,BSA被转移到Immobilon®-P转印膜上,后面有一块备用的Immobilon®-PSQ转印膜,采用槽转印系统,以25 mM Tris、192 mM甘氨酸和10%甲醇作为转印缓冲液。系统以8V/cm极间距离运行。在2小时的转印结束时,凝胶和膜被染色。BSA条带被切下并计算。

(实际内容以《蛋白质印迹手册》印刷版为准,如有错漏,敬请谅解)

立即索取印刷版《蛋白质印迹手册》

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