蛋白质印迹手册17:蛋白质观察[创新技巧]

【字体: 时间:2014年08月28日 来源:默克密理博

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  下列操作介绍了对固定在Immobilon® PVDF转印膜上的蛋白质进行染色的典型步骤。注意:在观察一块染色的印迹时,当膜还是湿的时,对比度是最好的。在照相时,使用湿的印迹和透过膜的光。

下列操作介绍了对固定在Immobilon® PVDF转印膜上的蛋白质进行染色的典型步骤。注意:在观察一块染色的印迹时,当膜还是湿的时,对比度是最好的。在照相时,使用湿的印迹和透过膜的光。

提示:在免疫检测之前只能使用可逆染料或透照。
提示:为了观察微弱的条带,将甲醇浓度提高到40%。

1 通过透照法观察

透照法是一种非破坏性的可逆技术(Reig和Klein,1988)。这种方法是基于PVDF膜浸泡在甲醇中,会从不透明变为半透明。20%的甲醇会使包被有蛋白质的膜浸湿,而无蛋白质的区域不会。

提示:在开发一种新的转印操作或处理一种新的样品类型时,凝胶应被染色,以验证所有蛋白质是否从凝胶上彻底洗脱。
放置在光盒中,蛋白条带会表现为透明的区域。与照相结合使用时,检测灵敏度与考马斯亮蓝染料相当。

必需的设备和溶液
• 20%(v/v)甲醇
• 浅托盘,能容纳膜
• 白色光盒
• 黑纸

步骤
1. 利用操作1.7 膜干燥方法(第44页)中的一种方法,让印迹彻底干燥。
2. 在托盘中加入足量20%的甲醇,以覆盖印迹。
3. 将印迹放在20%甲醇中5分钟。
4. 将印迹放在光盒中,用一张黑纸遮盖印迹周围的区域。
5. 条带变成透明区域,而背景不透明(图10,印迹A,第24页)。
6. 如果需要永久记录,对湿的印迹照相。
7. 当所有甲醇干燥后,印迹将恢复成它原先的样子。

2 通过可逆染色观察

丽春红
这种染料产生浅色背景下的粉红条带。

必需的设备和溶液
• 染料:0.2%丽春红、1%乙酸。按1:10用1%(v/v)乙酸稀释储液(20%染料,溶于30%(w/v)三氯乙酸和30%(w/v)磺基水杨酸)而制备。
• 甲醇,100%。
• 0.1 N NaOH。
• Milli-Q® 水。
• 浅托盘,能容纳膜。

步骤
1. 如果印迹是干燥的,在100%甲醇中浸湿。
2. 在托盘中加入足量的染料,以覆盖印迹。
3. 将印迹放入染料中,摇动1分钟。
4. 取出印迹,用Milli-Q® 水彻底冲洗,直至达到所需的对比度。
5. 若要彻底去除染料,用0.1 N NaOH清洗印迹。


CPTS(酞菁铜四磺酸)
这种染料产生浅色背景下的翠蓝色条带。

必需的设备和溶液
• 染料:0.05%(w/v)CPTS,溶于12 mM HCl。
• 脱色液I:12 mM HCl。
• 脱色液II:20%(v/v)甲醇。
• 甲醇,100%。
• 0.1 N NaOH。
• Milli-Q® 水。
• 蛋白脱色液:0.5 M NaHCO3。
• 浅托盘,能容纳膜。

步骤
1. 如果印迹是干燥的,在100%甲醇中浸湿。
2. 在托盘中加入足量的染料,以覆盖印迹。
3. 将印迹放入染料中,摇动1分钟。
4. 将印迹放入脱色液I中,去除多余的染料,达到所需的对比度。
5. 若要彻底去除背景中的染料,用脱色液II清洗印迹。
6. 若要使蛋白脱色,在蛋白脱色液中摇动,直至染料去除。

3 通过不可逆染色观察

考马斯亮蓝R染料
这种染料在浅色背景下产生深色条带。
切记:这种染料会干扰免疫检测。

必需的设备和溶液
• 染料:0.1%(w/v)考马斯亮蓝,溶于50%(v/v)甲醇和7%(v/v)乙酸。
• 脱色液I:50%(v/v)甲醇和7%(v/v)乙酸。
• 脱色液II:90%(v/v)甲醇和10%(v/v)乙酸。
• 甲醇,100%。
• Milli-Q® 水。
• 浅托盘,能容纳膜。

步骤
1. 如果印迹是干燥的,在100%甲醇中浸湿。
2. 在托盘中加入足量的染料,以覆盖印迹。
3. 将印迹放入染料中,摇动2分钟。
4. 取出印迹,用Milli-Q® 水短暂冲洗。
5. 将印迹放入脱色液I中,摇动10分钟,以去除过量的染料。
6. 将印迹放入脱色液II中,摇动10分钟,以彻底使背景脱色。

氨基黑
这种染料在浅色背景下产生深色条带。
切记:这种染料会干扰免疫检测。

必需的设备和溶液
• 染料:0.1%(w/v)氨基黑,溶于25%(v/v)异丙醇和10%(v/v)乙酸。
• 脱色液:25%(v/v)异丙醇和10%(v/v)乙酸。
• 甲醇,100%。
• Milli-Q® 水。
• 浅托盘,能容纳膜。

步骤
1. 如果印迹是干燥的,在100%甲醇中浸湿。
2. 在托盘中加入足量的染料,以覆盖印迹。
3. 将印迹放入染料中,摇动2分钟。
4. 取出印迹,用Milli-Q® 水短暂冲洗。
5. 将印迹放入脱色液中,摇动5-10分钟,以去除过量的染料。

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