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蛋白质印迹手册18:标准的免疫检测方法[创新技巧]

【字体: www.ebiotrade.com 时间:2014年8月29日 来源:默克密理博

摘要:

  标准的免疫检测是在电转移后直接在转印蛋白上开展的。湿润印迹上未被占据的膜结合位点被优化的试剂所封闭。此方法的缺点是需要封闭,且所需的总时间超过4小时。优点是对于新的样品类型而言,标准的免疫检测可能需要较少的优化。

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标准的免疫检测是在电转移后直接在转印蛋白上开展的。(如果膜在转移后已干燥,在甲醇中浸泡5分钟,彻底润湿印迹,再继续进行免疫检测。)湿润印迹上未被占据的膜结合位点被优化的试剂所封闭(详见操作1.5 优化封闭试剂,第41页)。此方法的缺点是需要封闭,且所需的总时间超过4小时。优点是对于新的样品类型而言,标准的免疫检测可能需要较少的优化。

提示:Immobilon®-PSQ转印膜的孔径(0.2 μm)比Immobilon®-P转印膜(0.45 μm)更小,且表面积更高。使用Immobilon®-PSQ膜预计会得到更高的背景,封闭和清洗步骤需要相应调整。
提示:封闭液中的磷酸酶可能会使印迹蛋白去磷酸化。
提示:请勿在缓冲液中加入叠氮化钠,因为它会抑制HRP的活性。
建议 – 在封闭时及之后请勿让印迹变干。
提示:如果在容器中放入不止一张印迹,缓冲液量不够将导致印迹粘在一起。
提示:脱脂奶粉不能用于生物素-亲和素系统。
提示:显色检测的灵敏度至少比化学发光检测低一个数量级。
提示:高的非特异信号可通过一抗的更高稀释或降低凝胶上的蛋白上样量来缓解。
提示:干的或湿的Immobilon®-FL膜均可扫描。
提示:通过酶结合二抗的更高稀释,可尽量避免高的整体背景。

必需的溶液
• 一抗(目的蛋白特异的)。
• 二抗(一抗特异的),标记碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶。
• 适合酶的底物。
• 磷酸盐缓冲液(PBST):10 mM 磷酸钠、pH 7.2,0.9%(w/v)NaCl,最多0.1% 吐温20去污剂。
• TBST:10 mM Tris、pH 7.4,0.9%(w/v)NaCl,最多0.1% 吐温20去污剂。
• 封闭液:1%(w/v)BSA(牛血清白蛋白),0.05% 吐温20。
• Milli-Q® 水。

必需的设备
• 浅托盘,能容纳印迹。
• 玻璃板。
• 保鲜膜(如Saran™膜)、冷冻袋或纸片。
• 放射自显影胶片和暗盒。
• 暗室。
• 放射自显影胶片冲洗设备。

准备

1. 用封闭液将一抗稀释到所需的工作浓度。
2. 用封闭液将二抗稀释到所需的工作浓度。
注意:应准备足够的溶液,让每cm2 膜有0.1 mL抗体溶液(一抗和二抗)。

抗体孵育

1. 将印迹放入封闭液中,摇动孵育1小时。
2. 将印迹放入一抗溶液中,摇动孵育1小时。溶液应在膜表面自由移动。
3. 将印迹放入PBS中,清洗10分钟。用新鲜的缓冲液重复两次。
4. 将印迹放入二抗溶液中,室温或37°C摇动孵育1小时。
5. 将印迹放入PBS中,清洗10分钟。用新鲜的缓冲液重复两次。
6. 继续进行显色、化学发光或荧光检测。

显色检测

1. 根据制造商的说明准备底物。
2. 将印迹放入干净容器内,加入底物,以完全覆盖膜表面。轻柔摇动孵育10分钟,或直至信号达到所需的对比度。
3. 用Milli-Q® 水冲洗印迹,终止反应。
4. 不要将印迹保存在直射光下,以避免退色。印迹可干燥保存。

化学发光检测

根据制造商的说明操作。
1. 根据制造商的说明准备底物。
2. 将印迹放入容器内,加入底物,以完全覆盖膜。孵育1分钟。
3. 吸走多余的底物。
4. 将印迹放在一片干净的玻璃上,包在保鲜膜中。
注意:切成一定尺寸的纸片或冷冻袋也可使用。
5. 轻轻去除所有气泡。
6. 在暗室中,将包好的膜放在胶片暗盒中。
7. 将一张放射自显影胶片放在上面,盖上暗盒。
8. 曝光胶片。应采用多次曝光,从15秒到30分钟,以确定最佳的曝光时间;通常是1-5分钟。

荧光检测

必需的设备
• 蛋白转印到Immobilon®-FL转印膜上,并与抗体杂交。
• Mylar® 薄膜
• 荧光成像设备。

以下是荧光免疫检测的常规操作。为获得最佳结果,请参考随试剂提供的制造商操作指南。注意:如果使用化学荧光试剂,请按照试剂制造商的指南。

1. 将印迹放入稀释的荧光染料标记的二抗溶液中,轻柔摇动,孵育1小时。
2. 用清洗液清洗印迹3-5次,每次5分钟。
3. 将印迹放在一张干净的滤纸上干燥。
4. 如果使用薄膜包被,使用Mylar®膜。切勿使用Saran™保鲜膜,因为它允许光线透过,会淬灭荧光。
5. 利用适当的荧光扫描仪对印迹进行成像。

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