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CRISPR大规模来袭,你还在等什么[选购宝典]

【字体: 时间:2014年08月29日 来源:生物通

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  近来,CRISPR/Cas技术已经应用于各种生物(从疟蚊到斑马鱼),催生了大量的研究成果。各大商家也没有错失良机,它们开发出了大量的试剂和工具,帮助研究者们开展自己的CRISPR/Cas研究。

生物通报道:基因组编辑是生物学领域的一个常用策略,可以引入新突变来进行功能研究,也可以对致病突变进行修复。现在人们手头的编辑技术主要有三种,锌指核酸酶(ZFN)、TALEN以及CRISPR/Cas

这三种方法都要用到特异性核酸酶,在DNA上的指定位点引入双链断裂。细胞主要通过两种途径来修复这样的损伤,非同源性末端接合(NHEJ)和同源介导修复(HDR)。其种,同源重组修复能够按照根据研究者的指令改写DNA序列。目前,基因组编辑已经广泛用于基因敲除、探索疾病病因、开发新药物、以及基因治疗。

从根本上来看,上述基因组编辑技术都能完成任务。不过CRISPR/Cas诞生之后,风头很快就盖过了ZFNTALEN。这是因为,CRISPR/Cas系统不仅操作简便,还有着很大的多重化潜力。

近来,CRISPR/Cas技术已经应用于各种生物(从疟蚊到斑马鱼),催生了大量的研究成果。各大商家也没有错失良机,它们开发出了大量的试剂和工具,帮助研究者们开展自己的CRISPR/Cas研究。

琳琅满目的分子工具

ZFNTALEN需要进行克隆、基因工程和优化,而CRISPR/Cas只需要向细胞引入Cas9核酸酶和20个核苷酸的single-guide RNAsgRNA,引导RNA)。引导RNA负责将核酸酶带到正确的位点进行切割。

许多公司都提供有预设计的工具来表达CRISPR/Cas元件。举例来说,Sigma-Aldrich公司就提供了针对人、小鼠、大鼠所有基因的Cas9 sgRNA表达质粒,用户只需要在网上进行简单的选购。当然,你也可以根据自己的特殊需求进行定制。

“至少从表面上看,CRISPR基因组编辑实验设计起来要比ZFN直观得多,因为它涉及的是RNA-DNA相互作用,”Sigma公司的Shawn Shafer说。。(延伸阅读:Nature子刊:黄行许教授解决基因组编辑的脱靶问题

Sigma-Aldrich公司制备有纯化的sgRNA文库,这种即用型产品可以用来直接转染细胞,也可以与纯化的Cas9核酸酶一起使用。特别适合那些想建立转基因动物模型或担心质粒整合的研究人员。

此外,Sigma公司还提供有配对的切口酶(nickase)设计,该产品含有表达引导RNA的两个质粒,Cas9-D10A切口酶需要单独订购。这种切口酶是Cas9的突变蛋白,只切割一条DNA链,能够明显减少脱靶效应,同时保持高效的基因修饰。

                                           了解Sigma CRISPR产品的详细信息

Thermo Fisher公司也有一系列支持CRISPR/Cas应用的产品。GeneArt® CRISPR核酸酶载体有两个报告基团可选:橙色荧光蛋白(OFP)用于流式细胞分选,CD4用于磁珠富集。该产品能够有效选择和富集表达Cas9CRISPR RNA的细胞。此外,Thermo Fisher公司还提供有表达Cas9mRNA,既可以搭配RNA形式的sgRNA,也可以搭配相应的CRISPR Strings™载体(用U6启动子在细胞中表达sgRNADNA载体)。

Thermo公司的Helge Bastian介绍,CRISPR Strings™载体旨在让新手更容易进行基因组编辑。如果以RNA的形式引入核酸酶和sgRNA,“操作者就需要进行RNA处理的培训,还要小心避免富含RNase的环境,以免最重要的分子被降解。”使用DNA载体的话,操作起来就要简单得多。

                                立即索取ThermoFisher CRISPR产品的详细资料

rAAV和纯化的Cas

Horizon Discovery公司也提供有一系列CRISPR/Cas工具,比如组成型表达Cas9核酸酶的QuickStart细胞系,只需要添加相应的sgRNA,就能够进行基因组编辑。

 


该公司还开发了可用于基因组编辑的腺相关病毒载体(rAAV)。该公司的Eric Rhodes介绍说,rAAV作为单链DNA比传统质粒更容易进入细胞核,可以提供更有效的基因组编辑,只不过这种载体有片段大小的限制(大约5 kb)。

NEB公司推出的CRISPR新产品是纯化的Cas9核酸酶。该公司的Brett Robb指出,不通过表达载体或mRNA,直接将Cas9蛋白送进细胞,可以更精确的控制Cas9的使用剂量。目前已经有一些研究展现了这一策略的有效性。

韩国研究者构建了Cas9/sgRNA核糖核蛋白(RNP)复合体,并将其引入了体外培养的成纤维细胞和胚胎干细胞。他们发现,这一策略的位点特异性突变频率高达79%,而且减少了与质粒转染有关的脱靶突变。哈佛大学Alex Schier领导的研究团队,则通过显微注射将Cas9-sgRNA RNP引入斑马鱼胚胎。与Cas9 mRNAsgRNA的组合相比,Cas9-sgRNA RNP的突变生成率更高。

如何评估编辑的效率和准确性

为了评估基因组编辑的效率,Thermo Fisher公司推出了GeneArt Genomic Cleavage Detection Kit。该试剂盒的方案是,首先对编辑目标进行PCR扩增,随后将PCR产物进行变性和退火。已编辑和未编辑的扩增子存在序列差异,会在退火阶段形成不匹配的单链区域,而试剂盒里的酶可以切割这些区域。

                                      我想了解GeneArt基因组编辑检测试剂盒

另外,我们也可以通过基因组测序,来检测基因组编辑之后细胞中发生的改变。今年早些时候,Ayal Hendel及其同事使用PacBio RS深度测序,评估了ZFNTALENCRISPR/Cas的基因组编辑结果。

PacBio公司SMRT测序技术能带来15 kb的读长,正是这一特点让PacBio特别适合于基因组编辑的评估工作,Pacific Biosciences公司的Jonas Korlach说。在基因组编辑技术中,人们广泛使用有着长长一段同源臂的供体模板,以提高原代细胞的HDR效率。而这些供体模板对于Illumina等短读取系统来说太长了。

研究人员指出,不论是NHEJ编辑 还是HDR 编辑,CRISPR/Cas都比TALEN更加有效。更重要的是,他们还向人们展现了一种称为“mini-translocations”的现象。这一现象是指,编辑位点拷贝了错误的供体序列,比如表达核酸酶的质粒DNA,或者是其它细胞染色体DNA。研究人员甚至观察到了,来自TALEN表达载体的289个核苷酸插入。

据介绍,Hendel等人正在着手优化HDR编辑的效率,他们希望能够把这种技术应用到遗传性血液病的治疗中。目前HDR编辑造血干细胞的效率是3% 5%,“我们正在想办法提高效率,希望能尽快用这一技术进行基因治疗。”

CRISPR来了,你还在等什么呢?有这么多工具在手,你需要做的只是确定一个引导RNAAddgeneSigma-Aldrich等机构都提供有预设计的sgRNA文库。不过,如果你想要自己动手设计,这两个网站应该可以帮到你:CHOPCHOP,以及张锋博士的CRISPR Design

参考文献:

 [1] Kim, S, et al., “Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins,” Genome Res, 24:1012-9, 2014. [PubMed ID: 24696461]

[2] Gagnon, JA, et al., “Efficient mutagenesis by Cas9 protein-mediated oligonucleotide insertion and large-scale assessment of single-guide RNAs,” PLoS ONE, 9:e98186, 2014. [PubMed ID: 24873830]

[3] Hendel, A, et al., “Quantifying genome-editing outcomes at endogenous loci with SMRT sequencing,” Cell Reports, 7:293-305, 2014. [PubMed ID: 24685129]

Correction (Aug. 22): The original version of this document referred to the GeneArt portfolio as a product of Life Technologies. Life Technologies has been acquired by Thermo Fisher Scientific. The article has been updated to reflect that change.

 

Jeffrey M. Perkel撰写/叶予编译)

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