蛋白质印迹手册20:膜的剥离再生[创新技巧]

【字体: 时间:2014年09月05日 来源:默克密理博

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  下面介绍了两种从印迹上去除抗体的操作。第一种适用于所有化学发光底物系统,通过加热和去污剂的组合来释放抗体。第二种常用于抗体必须与抗原分离的应用,它采用低pH值来改变抗体的结构,通过这种方式处理后,结合位点不再有活性。

下面介绍了两种从印迹上去除抗体的操作。第一种适用于所有化学发光底物系统,通过加热和去污剂的组合来释放抗体。第二种常用于抗体必须与抗原分离的应用,它采用低pH值来改变抗体的结构,通过这种方式处理后,结合位点不再有活性。

这两种方法都不能去除显色检测系统所产生的有色沉淀(如BCIP、4CN、DAB和TMB)。不过,仍可以利用不同目标蛋白的另一种抗体来分析印迹。

切记:在多次免疫检测之间,印迹不能变干。如果它变干,任何残留的抗体分子将永远与膜结合。

1 通过加热和去污剂剥离

必需的设备和溶液
• 剥离溶液:100 mM 2-巯基乙醇,2%(w/v)SDS,62.5 mM Tris-HCl,pH 6.7。
• 磷酸盐缓冲液(PBS):10 mM 磷酸钠、pH 7.2,0.9%(w/v)NaCl。
• 浅托盘,能容纳膜。

步骤
1. 在通风橱内,将印迹放入剥离溶液中,在50°C摇动孵育30分钟。
2. 将印迹放入缓冲液中,摇动10分钟。重复一次,使用新鲜的缓冲液。
3. 可选:重复开始的检测操作(省略一抗步骤),以确保抗体已失活或从膜上剥离。
4. 将印迹放入缓冲液中,摇动10分钟。
5. 继续进行封闭步骤,进行下一轮的免疫检测。

2 通过低pH值剥离

必需的设备和溶液
• 剥离溶液:25 mM 甘氨酸-HCL,pH 2,1%(w/v)SDS。
• 磷酸盐缓冲液(PBS):10 mM 磷酸钠、pH 7.2,0.9%(w/v)NaCl。
• 浅托盘,能容纳膜。

步骤
1. 将印迹放入剥离溶液中,摇动孵育30分钟。
2. 将印迹放入缓冲液中,摇动10分钟。重复一次,使用新鲜的缓冲液。
3. 继续进行封闭步骤,进行下一轮的免疫检测。

3 利用ReBlot™ Plus Western Blot Recycling Kit剥离

必需的设备和溶液
• 标准的印迹或印迹条,在硝酸纤维素或PVDF/尼龙膜上。
• 封闭液。
• 保鲜膜,以保存那些不立即再次杂交的印迹。
• 蒸馏水,用于试剂的稀释。
• 塑料托盘,在剥离、清洗和封闭液中孵育印迹或印迹条时使用。
• 阳性和阴性剥离对照。

步骤
注意:印迹或单个印迹条若要重复使用,应在第一次使用后立即剥离。如果不能立即剥离,将膜包在保鲜膜中,保存在PBS中,置于4°C。切勿干燥保存印迹。
1. 在塑料托盘中装入适当量的1X Antibody Stripping Solution(试剂盒中提供)。
2. 利用镊子,将印迹或印迹条浸入剥离溶液中。轻柔混合,在室温下孵育15分钟。
3. 在一个干净的塑料托盘中装入相同量的封闭液。传统的封闭液如20 mM Tris HCL,pH 8.0;150 mM NaCl;0.1% 吐温20;5%奶粉或其他都可使用。

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