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蛋白质印迹手册21:蛋白质消化 & 印迹保存

【字体: www.ebiotrade.com 时间:2014年9月10日 来源:默克密理博

摘要:

  PVDF是一种耐化学性的聚合物,有着出色的长期稳定性。对于那些需要保存以供日后使用的印迹而言,保存条件是由与膜结合的蛋白质的稳定性决定的。我们建议低温保存,室温对一些蛋白质来说也足够。

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蛋白质消化

这种方法介绍了固定在Immobilon® PVDF转印膜上蛋白的制备,以便质谱分析。
提示:质谱兼容的膜染料包括考马斯亮蓝、氨基黑或Sypro印迹染料。

必需的设备和溶液
• 50%甲醇,溶于Milli-Q® 水中。
• 30%乙腈,50 mM碳酸氢铵
• 胰蛋白酶,溶解于Milli-Q® 水中,浓度为0.1 mg/mL。
• 80%乙腈,溶于Milli-Q® 水中。
• 真空过滤器。
• 微量过滤管。
• MALDI-TOF基质。

步骤
1. 将蛋白质从凝胶转移到膜上(蛋白质转印操作,第35-38页)。
2. 用考马斯亮蓝或氨基黑对转印膜进行染色(操作2.3 通过不可逆染料观察,第47页)。
3. 用水清洗染色的膜,并干燥。
4. 用干净的手术刀切下包含目的蛋白的膜,放入单独的微量离心管中。
5. 用500 μL 50%甲醇对膜进行脱色,室温下脱色2小时。
6. 弃上清,让膜干燥。
7. 加入10 μL 30%乙腈,50 mM碳酸氢铵和4 μL 0.1 mg/mL胰蛋白酶。
8. 室温下过夜孵育。
9. 将上清转移至干净的微量离心管。
10. 用20 μL 80%乙腈超声处理15分钟,提取肽段。
11. 将提取物与之前的上清液合并。
12. 在真空离心管中干燥消化物。
注意:或者,使用默克密理博的ZipTip®SCX移液器吸头来纯化和浓缩肽段消化物,以取代干燥。若要使用此方法,用0.5% TFA(确保pH <3)酸化消化物,并按照ZipTip®SCX移液器吸头的操作指南进行(默克密理博刊物编号 P36444)。
13. 以少量30%乙腈、0.1% TFA重悬每个肽段提取物。
14. 将1-2 μL 消化物上样到MALDI板上,并与1 μL基质混合。

印迹保存

PVDF是一种耐化学性的聚合物,有着出色的长期稳定性。对于那些需要保存以供日后使用的印迹而言,保存条件是由与膜结合的蛋白质的稳定性决定的。我们建议低温保存,室温对一些蛋白质来说也足够。

必需的材料
• 干燥的Immobilon® PVDF转印膜。
• 两张Whatman® 3MM滤纸。
• 两张卡纸或薄的硬纸板。
• 回形针。
• 塑料袋。

步骤
1. 将干燥的印迹放在两张干净的Whatman® 3MM滤纸中间。
2. 将印迹-滤纸三明治放在两张卡纸之间。
3. 用回形针夹住边缘。回形针不应与印迹重叠。
4. 将它们放入可密封的塑料袋中。
5. 关闭或密封塑料袋。
6. 将印迹保存在所需的温度:
4°C 最多2周
20°C 最多2个月
70°C 长期保存

注意:保存在冰箱中的印迹不能受到机械振动,这会导致膜破损。印迹应恢复到室温后,才从塑料袋中取出。印迹也可放在塑料袋中,置于4°C,但应加入叠氮化钠等杀菌剂,以防止细菌生长。在使用之前,必须彻底洗掉叠氮化物,因为它会抑制HRP的活性。

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立即索取印刷版《蛋白质印迹手册》

(http://www.ebiotrade.com/)

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