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如何设计我的CRISPR/Cas实验[心得点评]

【字体: 时间:2015年01月19日 来源:生物通

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  CRISPR基因组编辑是目前大热的新技术,它利用短RNA(gRNA)来引导核酸酶(Cas9)到达DNA靶点。与之前的基因组编辑方法(ZFN和TALEN)相比,这种新方法具有快速、高效、廉价且易于操作等优点,因而被快速采用。眼看着CRISPR频频出现在各大期刊上,也许你也想尝试一下这种新技术。在此,我们就介绍一下CRISPR实验的一些主要步骤,以及需要考虑的因素。

CRISPR基因组编辑是目前大热的新技术,它利用短RNA(gRNA)来引导核酸酶(Cas9)到达DNA靶点。与之前的基因组编辑方法(ZFN和TALEN)相比,这种新方法具有快速、高效、廉价且易于操作等优点,因而被快速采用。眼看着CRISPR频频出现在各大期刊上,也许你也想尝试一下这种新技术。在此,我们就介绍一下CRISPR实验的一些主要步骤,以及需要考虑的因素。

1. 选择一个CRISPR系统

首先,你要考虑一下为什么要使用CRISPR系统,是破坏感兴趣的基因,还是编辑或修饰内源的基因组?这需要通过不同的修复途径来实现。

破坏感兴趣的基因

Cas9核酸酶有两个功能结构域:RuvC和HNH,每个切割一条不同的DNA链。当这两个结构域激活时,Cas9在基因组DNA上产生双链断链(DSB)。在缺乏适当的修复模板时,DSB通过非同源末端连接(NHEJ)途径来修复。在NHEJ修复过程中,DSB位点会随机插入或删除几个核苷酸,这可能带来插入缺失(InDel)。InDel改变目的基因的开放阅读框(ORF),可能明显改变DSB下游的氨基酸序列。此外,InDel可能引入提前终止密码子。这种修复的结果就是目的基因被破坏。不过需要注意的是,NHEJ引入的InDel是随机的,因此需要通过实验来确定基因破坏的类型和程度。

编辑/修饰内源基因组

CRISPR系统也能在目标序列上引入特定的核苷酸修饰,这就要依靠另一种修复机制:同源指导修复(HDR)。在HDR修复过程中,必须存在一条包含所需序列的DNA修复模板。DNA模板通常与gRNA/Cas9一起转染到细胞中,并且必须与DSB上下游的序列有着很高的同源性。当合适的模板存在时,HDR能在Cas9诱导的DSB上引入特定的核苷酸修饰。同样,这个修饰也必须通过实验来证实。

目前有多个厂家提供CRISPR质粒,包括Life Technologies、Sigma-Aldrich等。他们大多提供all-in-one的系统,既表达Cas9核酸酶,又表达gRNA,这样很方便。具体可看我们之前的系列文章:CRISPR新品巡礼。

此外,许多科学家也对CRISPR/Cas系统的一些元件进行了改造,以增强系统的特异性或实现某些特定的功能。如果你需要这样的一些质粒,可以去Addgene网站上查找(www.addgene.org)。同时,它也收录了一些知名的实验室设计的质粒。Addgene是一个非营利性组织,主要是为了减少研究人员索取质粒的繁琐过程,但它会收取一定的手续费和运费。

Addgene目前在中国的经销商是北京中原公司。这也就是说,你在网站上找到了感兴趣的质粒,可以通过电话(400-8100-881/86-10-84415678)或电子邮箱 (addgene@sinozhongyuan.com) 的方式向北京中原公司下订单。


2. 设计你的gRNA

一旦你决定了使用哪种系统,下一步就是设计你的gRNA啦。在基因组DNA中选择适当的目标序列,这对实验设计来说是非常重要的一步。

基因组靶点的重要特征包括:

• 长度大约在20个核苷酸。
• 后面(或前面)是PAM序列。注意:PAM随着Cas9来源的细菌种类的不同而变化。Cas9和gRNA必须来自同一种细菌。

对于设计的gRNA,它:

• 不包含PAM序列。
• 可以是基因组DNA的任一条链。
- 对于基因组破坏,gRNA靶定的位点应靠近蛋白编码区的N端,以便增加基因破坏的可能性。
- 对于基因组编辑或修饰,gRNA靶定位点将限于编辑或修饰的位置。
• 应利用生物信息学软件来设计,以尽量避免脱靶效应。

以下总结了一些设计gRNA的软件。同时,Addgene也提供一些经过验证的gRNA。

张锋实验室的Target Finder:http://crispr.mit.edu/
Michael Boutros实验室的E-CRISP:http://www.e-crisp.org/E-CRISP/designcrispr.html
CasFinder:http://arep.med.harvard.edu/CasFinder
CRISPR Optimal Target Finder:http://tools.flycrispr.molbio.wisc.edu/targetFinder/

Broad研究院的CRISPR专家John Doench曾经分享了一些设计gRNA的经验,请看:CRISPR实验中如何设计gRNA

3. 将gRNA克隆到质粒中

这一步不必多说,就是普通的克隆,大家都是专家。克隆之后,通过测序来验证最终的质粒产物。

4. 导入CRISPR元件

如果你使用的是哺乳动物细胞,那么自然可以使用一些常用的DNA导入方法,比如转染、电穿孔和病毒导入。对于普通的细胞系(如HeLa、HEK 293),转染并非难题,哪种方法都行。对于ES细胞和iPS细胞,电穿孔的方法效果会更好。对于原代细胞,病毒导入可能更理想。如果你用的是其他的模式生物,比如线虫、斑马鱼,那么可以参考Addgene上的实验方案(http://www.addgene.org/CRISPR/reference/#protocols)。

5. 评估效果

一些公司已经推出了试剂盒来评估基因组编辑的效率,比如Life Tech的GeneArt® Genomic Cleavage Detection Assay,采用错配检测内切酶来检测细胞内NHEJ修复期间因插入和/或删除而产生的插入或缺失。Clontech也推出了Guide-it Mutation Detection Kit。当然,你还可以通过测序对序列进行验证。CRISPR与新一代测序相遇,会擦出怎样的火花?欢迎阅读:在CRISPR/Cas9相关研究中应用新一代测序技术。(生物通 薄荷)

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