我科学家用CRISPR研究肝癌干细胞

　　

生物通报道：近期，来自北京大学医学部、北京东方亚美基因科技研究院和南方医科大学的研究人员，在国际学术期刊《Oncotarget》发表题为“Knock out CD44 in reprogrammed liver cancer cell C3A increases CSCs stemness and promotes differentiation”的研究成果。北京大学医学部的沈丽教授和南方医科大学第二临床学院肝胆二科的主任医师高毅，是本文共同通讯作者。

日本科学家山中伸弥研发的体细胞重编程，可诱导多能干细胞（iPS），因此获得了2012年的诺贝尔生理学或医学奖。自那以来，人们普遍相信，iPS细胞将成为各种疾病建模和治疗的便利平台。更多的注意力都集中在癌细胞重编程，以构建肿瘤干细胞（CSCs）模型。CSCs对于肿瘤研究至关重要。目前，CSCs的来源和演化仍有争议。癌细胞重编程，可以显示出癌症的进展，从早期到晚期阶段。在肿瘤发展的体外模拟过程中，不同阶段的标志物和肿瘤发展的信号通路的动态变化，将是清晰可辨的。延伸阅读：中国学者973项目发表Nature子刊文章：肝癌干细胞 。

肝癌是世界上第五大最常见的癌症。肝癌的发展与肝脏发育有着相似的特点，包括干细胞的发育和维持。肝脏CSCs表示具有自我更新能力和干细胞特性的一部分细胞，这些特性可能有助于转移性、耐药性和耐辐射，此外，肝脏CSCs可导致肝脏肿瘤的异质性表型。CSCs是标志物阳性的，肝脏CSCs标志物包括CD13、CD24、CD44、CD90、CD133和EpCAM，这些标记可引起肿瘤的高度侵袭性特点及耐药性。

在肝脏CSCs标记物中，CD44主要协助其他标记分离肝CSCs。据报道，一种CD44变体可影响氧化还原状态，以保护CSCs免于肝癌中的氧化应激。实际上，CD44众所周知是一种CSCs标记，不仅在肝癌，也在胃癌、乳腺癌、急性髓系白血病中。糖蛋白CD44位于细胞表面，其参与细胞间的相互作用、细胞的黏附和迁移。CD44 mRNA的可变剪接，会产生多个具有不同功能的异构体。在淋巴细胞活化、回收和归巢、癌症的发展和转移过程中，可检测到CD44。

在这项研究中，研究人员选择了来源于HepG2的人肝细胞癌细胞系C3A。四个山中因子OSKM被转染到C3A细胞中。然后，研究人员成功得到了C3A衍生的肝CSCs模型，随后被命名为C3A诱导的肿瘤干细胞（C3A-iCSCs）。C3A-iCSCs被认为是CD44阳性和CD133阴性。

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与CD133+CD44- C3A细胞相比，CD133-CD44+ C3A-iCSCs显示出自我更新和干性特征。研究人员发现，CD44主要位于C3A-iCSCs的细胞核中，并结合到肿瘤相关基因c-MYC的启动子区域和干细胞标记物SOX2。

为了探讨CD44基因在肝癌干细胞中的整体功能，研究人员使用CRISPR/Cas9系统，敲除了C3A-iCSCs中的CD44。与CD44+ C3A-iCSCs相比，CD44- C3A-iCSCs在小鼠中表现出较高的多能性，在异种移植后肿瘤细胞的分化增加。这项研究证实，CD44通过保持低分化的肿瘤细胞群，在肝癌干细胞中发挥重要功能。这一发现表明，CD44可能是未来肝癌治疗的一个重要研究对象。

（生物通：王英）

注：沈丽，博士生导师、教授。1983年毕业于北京医科大学基础医学系，获医学学士学位，1986年在北京医科大学获医学硕士学位，1986年8月至今在北京医科大学解剖学系任教，1992年9月至1993年8月在香港大学解剖学系CMB进修，任RAⅡ。现任北京大学干细胞研究中心及解剖学与组织胚胎学系教授、博士生导师。

高毅，男，主任医师，博士生导师，工作于南方医科大学第二临床学院肝胆二科。现任国家高技术研究发展计划（863计划）重大项目《人源细胞混合型生物人工肝的研制与开发》课题组长。国家和广东省科技成果评审专家；国家自然科学基金和广东省自然基金评审专家；广东省肝脏病学会（省一级）常务理事、中华医学会广东省外科学会委员等学术职务；《世界华人消化杂志》常务编委，《中华肝胆外科杂志》等6种医学专业杂志编委和特约编委。

生物通推荐原文摘要：
Knock out CD44 in reprogrammed liver cancer cell C3A increases CSCs stemness and promotes differentiation
ABSTRACT：CD44 is a widely known cancer stem cells marker in various cancers and validated to function in tumor growth, survival and tumor metastasis. In this study, we first established C3A-derived liver cancer stem cells by OSKM method [OCT4, SOX2, KLF4, and c-MYC], termed C3A-induced cancer stem cells (C3A-iCSCs) which acquired self-renewal and stemness abilities. Then we found CD44 was positive in C3A-iCSCs and mainly located in cell nuclear. Chromatin immunoprecipitation-quantitative PCR (ChIP-qPCR) results showed nuclear CD44 combined promoter regions of c-MYC and SOX2. These results suggested that CD44 participated in C3A-iCSCs transcriptional regulation. To explore CD44 overall influence in liver cancer stem cells, CD44 was knocked out in C3A-iCSCs using CRISPR/Cas9 technology. Our results showed a dramatic increase in the expression of stem cell markers OCT4, SOX2 and NANOG in CD44− C3A-iCSCs compared with that in CD44+ C3A-iCSCs. Tumor derived from CD44− C3A-iCSCs also displayed well-differentiated tumor cells compared to CD44+ C3A-iCSCs, which suggested CD44− C3A-iCSCs derived tumor cells exhibited lower malignant degree. Our data indicated nuclear CD44 in liver cancer stem cells is responsible for the poorly differentiated highly malignant tumor cells by maintenance of low stemness state.