新一代测序2015更新：小鲜肉与大叔（下）

小鲜肉常有，而大叔不常有。经过岁月的洗礼，大叔褪去了小鲜肉的稚嫩与青涩，愈发成熟，更显魅力。Illumina、Pacific Biosystems便是这样的帅大叔。他们上市多年，在市场上占据一定的地位，应用也日趋广泛。

Pacific Biosciences

2014年，PacBio的SMRT技术发表在多个重要期刊上，而仪器销量也节节攀升，代表了它的价值为更多人所认可。Bio-IT World曾如此评价PacBio：2014年可以看作PacBio年，这家公司证明了高价仪器在市场上仍有空间。

在今年的AGBT大会上，PacBio作为金牌赞助商，举行了一个明星云集的研讨会，展示了SMRT（单分子实时）测序仪所能实现的成就。演讲者包括J. Craig Venter，他运行着世界上最大的基因组测序中心；Deanna Church，作为基因组参考联盟（Genome Reference Consortium）中的一员，她正协助改进人类参考基因组；以及Gene Myers，世界上顶尖的生物信息学家之一。他们都介绍了人类基因组de novo组装方面的工作。

Venter在会议上发表演说，表示他将结合两台SMRT测序仪以及20台超高通量的Illumina HiSeq X仪器，在Human Longevity公司中产生30个新的人类参考基因组。这些不同种族和地域背景的参考基因组，将有助于在今后解释大的结构变异。在不同群体之间，结构变异相差很大，很难与单个参考基因组一致。Venter还表示，他计划在2020年之前测序一百万个全基因组。

Gene Myers则对PacBio开辟了相对简单的de novo组装非常感兴趣。在去年的AGBT上，Myers通过与PacBio的CEO Mike Hunkapillar交谈，了解到SMRT测序仪通过基因组的随机采样带来长的读取，以及无偏向的随机错误。“作为一名数学家，当Mike在两个地方用了‘随机’这个词时，我感到无比兴奋。”Myers在今年的研讨会上表示。“因为我知道，单从理论上讲，这意味着完美组装再次成为众人的焦点。”

从那时起，Myers就一直努力让完美组装成为现实。他开发出目前常用的比对工具DALIGNER，以及一种新工具DAscrub。DAscrub的目的是清理PacBio的原始读取，而不牺牲有价值的数据。Myers展示了大肠杆菌基因组的组装成果。他们在运行DALIGNER后，开展完整组装前，只利用DAscrub来清除artifacts，而不需要任何校正步骤。

Deanna Church之前在NCBI任职，现在担任Personalis公司基因组学与内容的高级总监。在AGBT上，Church指出，在开展de novo组装时，参考基因组是必要的，既可作为检出变异的资源，又可作为描述变异的坐标系。这意味着参考基因组中的序列丢失可能导致解释出问题。

Church还提到了人类参考基因组的最近一次更新增加了许多替代位点。她敦促生物信息学家更新他们的工具，以便将这些位点考虑在内。这些替代位点贡献了3.6 Mb的新颖序列，包含153个独特基因。同时，Church也承认，这种替代位点的拼凑并不是表示整个基因组中大的结构变异的最有效方式。

之后，千年基因总部Macrogen创始人Jeong-Sun Seo教授也登上演讲台，介绍了亚洲人基因组计划的最新进展，并展示了基因组学的一个重要新资源，亚洲基因组的二倍体组装。“我们必须考虑个性化医疗的种族差异，”Seo 提醒观众。因此，绘制亚洲人参考基因组图谱也成为亚洲人基因组计划的首要目标。

千年基因采用三种不同的方法开展亚洲人基因组de novo测序，分别是三代测序平台PacBio RS II与二代测序平台HiSeq X Ten相结合、仅采用PacBio RS II平台、PacBio RS II平台完成测序组装并以BAC克隆的数据进行gap filling。研究结果表明，PacBio RS II平台与BAC克隆相结合的方法得到的结果最优。

此外，千年基因对组装结果进行了深入的变异分析，并鉴定到大量特有的序列及结构变异。以20号染色体为例，仅这条染色体就发现了196个新的插入及260个新的缺失变异，插入缺失变异的序列长度平均为634bp。同时，在NINL基因鉴定到一个8Kb的插入变异，该基因与色素沉着相关，并且在黄种人和白种人之间存在极显著的表达差异。

尽管与竞争对手相比，PacBio的通量较低，成本较高，但它具有短读取测序所无法比拟的优势，如单体型分析和捕获结构变异。当然，PacBio也在不断升级，也许会带来更加经济的长读取测序。

我想深入了解PacBio的测序技术

Illumina

Illumina照例在1月份的摩根大通保健大会上揭开了新产品的面纱。这一次，它带来了四款新的测序系统，分别是HiSeq X Five系统、HiSeq 3000和HiSeq 4000系统，以及NextSeq 550系统。

HiSeq X Five是去年推出的顶尖平台HiSeq X Ten的缩小版本，包括五台HiSeq X测序仪。HiSeq X Ten系统在年初上市后反响热烈，大大超乎Illumina的预期。起初，Illumina表示将供应给五名客户，但到了年底，HiSeq X测序仪共售出201台，客户数达到18名。不过对于有些测序中心而言，HiSeq X Ten的价格太高，通量太大。为此，Illumina今年推出了HiSeq X Five。

HiSeq X Five的售价约为600万美元，每年能测序9000个基因组，而每个基因组的费用约为1400美元，高于HiSeq X Ten的1000美元。不过，用户在升级到10台仪器之后，也能实现千元基因组测序。（价格仅供参考，不适用于中国）

双流动槽的HiSeq 4000和单流动槽的HiSeq 3000是基于成熟的HiSeq 2500系统，不过没有了2500的“快速运行模式”。HiSeq 4000的售价为90万美元，能够在3.5天内测序12个基因组、100个转录组或180个外显子组。HiSeq 3000的售价为74万美元，通量为HiSeq 4000的一半。

与之前的版本相比，HiSeq 3000/4000的重大改进是流动槽设计。早期的HiSeq仪器使用非图案化的流动槽，这样测序簇可在表面的任何地方形成。因此，测序簇的大小、性状和间隔不均匀，而数据分析的步骤之一就是确定它们在哪里。而新的仪器（包括HiSeq X系列）采用了图案化的流动槽，让测序簇限制在400 nm的孔中。这种有序的结构使得簇间隔均匀和特征大小均一，便于准确分辨以极高密度成簇的流动槽，使得通量大幅提高。不过，需要注意的是，HiSeq 3000/4000与HiSeq 2500的硬件系统不同，故无法从HiSeq 2500直接升级到HiSeq 3000/4000，两者的试剂也不能混用。

NextSeq 550系统则是整合了高通量测序和芯片扫描功能。在测序方面，NextSeq 550的测序模块与NextSeq 500完全相同；在芯片扫描方法，它目前支持Infinium CytoSNP-12、Infinium CytoSNP-850K和Infinium HumanKaryomap-12三款芯片，适用于细胞遗传学和生殖健康。NextSeq 550系统的价格为27.5万美元。

在测序越来越省力的今天，样品制备仍是一项艰巨的任务，占据了大多数的手工操作时间。为了减轻样品制备的负担，Illumina在AGBT大会前夕，推出了自动化的文库制备平台 – NeoPrep系统。

NeoPrep系统包括NeoPrep台式仪器、一次性的文库卡片（library card）和试剂。它单次运行即可制备、定量和均一化文库。数字微流体精确操控纳升大小的液滴，最终将剪切的DNA或RNA转变成测序即用的文库。这种革命性的技术实现了16个文库的平行制备，而手工操作只需30分钟。与NeoPrep同步上市的，还有TruSeq Nano DNA Kit和TruSeq Stranded mRNA Kit的NeoPrep版本。其他文库制备产品将在今年晚些时候上市。（生物通 余亮）

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