新一代测序2015更新：小鲜肉与大叔（上）

从2005年454公司首推新一代测序仪以来，转眼已是十年光阴。在这十年间，许多新平台问世，有的昙花一现，有的则从小鲜肉变成了帅大叔。当然，这是一个小鲜肉辈出的时代。新的平台仍在不断上市，带来进步，带来希望。

10X Genomics

在2月份举行的基因组生物学技术进展大会（AGBT）上，10X Genomics公司推出了GemCode™ 测序平台。这家公司于2012年创立，总部位于美国加利福尼亚州普莱森顿。它的几位创始人之前曾创办了数字PCR公司QuantaLife或担任高管，之后的故事也许大家听说过。Bio-Rad收购了这家公司，并推出了QX100微滴式数字PCR平台。

近年来，基因组测序的确变得更快速、更廉价，然而如今的基因组仍然有不少缺口。这部分原因在于技术层面。当今的技术将生物学样品打断成微小片段，通过测序仪读取，随后利用计算机将其组装成完整的基因组。这种拼图的方式难度颇大。短读取技术不擅长单体型分析（判断变异是来自父亲还是母亲），或检出结构变异（大片段的DNA改变）。10X Genomics的想法，正是改变测序的定义。

GemCode平台由仪器、试剂盒和信息学软件组成。用户将DNA样品加入GemCode芯片，同时加入凝胶珠和分液油。在仪器的微流体系统内，分液油将长的DNA分子（达100 kb）分到不同的宝石。每个宝石中的DNA随后被片段化成短读取的文库，用于Illumina测序，而每个片段上带有一个14个碱基的分子条形码，代表它来源的宝石。

之后，GemCode软件做了一些Illumina测序仪无法做到的事情：将之前分开的短读取连接起来，产生一种新的数据类型：连接读取（linked reads）。由于每个片段都带条形码，了解它们原先所在的分子就不是什么难事。这种分液模式也使得GemCode能处理微量的DNA样品，据称是1 ng。

通过这种方式，研究人员利用GemCode平台和原先的Illumina测序仪，就能获得长片段的信息，而不需要去购买一台全新的测序仪。据10X Genomics介绍，GemCode平台的售价约为75,000美元，而耗材成本大约是每个样品500美元。

目前还没有其他技术能够以这个价格来捕获大的结构变异，分析单体型，或开展大型基因组的de novo组装。10X Genomics及早期试用客户正在尝试这些。他们也在AGBT上展示了初步的成果。

以基因融合为例，通过GemCode条形码开展的全基因组和外显子组测序不仅重复了之前实验中发现的基因融合，还在肺癌细胞系NCI-H2228中发现了一个新的基因融合，介于ALK和EML4之间。

10X Genomics计划在2015年第二季度开始发售GemCode。目前所有的数据都来自公司本身或早期试用的用户。也许，我们要等到第一批客户拿到手之后，才能真正了解它的表现如何。顺便提一下，它目前只与Illumina测序仪兼容。

Oxford Nanopore Technologies

Oxford Nanopore Technologies这个小鲜肉也一直是人们关注的热点。2012年初，Oxford Nanopore在AGBT上首次发布了MinION测序仪的消息。这台仪器大小与U盘相仿，价格低于900美元，立即引发市场轰动。然而，雷声大，雨点小。之后一直鲜有MinION测序仪的消息。直至2013年底，MinION开放试用，才重新成为热门话题。

如今，数百台MinION已经发往近40个国家。从第一批幸运的用户拆开箱子到现在，已有大半年的时间。有的用户已发表论文，有的则在会议上介绍他们的成果。

日本冲绳县工业技术中心的研究人员利用MinION对λ噬菌体的基因组以及蛇毒腺转录组的扩增子进行了重测序。不过，他们认为MinION的错误率高，只有四分之一的读取能定位到参考序列。Oxford Nanopore公司并未对此作出回应。不过，一些科学家认为这个结论不够成熟，研究可能使用了早期的试剂。

的确，Oxford Nanopore正在迅速更替平台的每一方面：文库制备、操作、流动槽及软件。据介绍，文库制备已经过数次的更新，使得数据准确性提高，操作流程缩短，且稳定性更好。流动槽也已经升级到第三版，每次升级都增加了纳米孔的数量，以及数据产量和质量。仪器控制软件MinKnow和碱基检出软件Metrichor也经过更新，可改进数据质量和分析速度。

之后，研究人员也展示了不错的研究成果。例如，一项研究使用MinION对三个药物基因组学相关位点的PCR扩增子进行测序。这三个位点分别是HLA-A、HLA-B和CYP2D6基因。利用长达4 kb至5 kb的读取，研究人员能够对三个靶向区域进行完全测序和单体型分析。作者认为，这一结果表明MinION有望应用在临床中，协助医生做决定，但它的高错误率仍是个问题。这项成果发表在《F1000Research》杂志上。

在另一项研究中，加州大学圣克鲁斯分校的研究人员介绍了一种计算工具，分析并提取MinION数据中的单核苷酸多态性。他们生成了长达42 kb的读取，并以此来填补了人类X染色体上一段50 kb的缺口。

研究人员报告了MinION读取的“平均一致性（mean identity）”，即读取与参考序列的匹配程度。在大约29,000个读取中，这种一致性达85%。作者认为，MinION有着足够的准确性，能通过测序长的DNA链来解决重要的生物学问题。“这种准确性正在迅速改善，”他们写道。

当然，纳米孔测序仍是一项全新的技术，也许存在这样那样的问题。不过，MinION的价格低于1000美元，读长达到kb级别。若能进一步改善准确性问题，势必掀起科研和医疗的革命。毕竟，有能力购买高通量测序仪的实验室只是少数。

现在，Oxford Nanopore又重新开放了MinION测序仪的早期试用计划。如果你有兴趣，请尽快申请，可抢先一步试用这款迷你的测序仪。如果你对全基因组测序感兴趣，那么还需要耐心等待，它的另一款高通量测序仪PromethION会在晚些时候开放试用。（生物通 余亮）

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