CRISPR操作指南进阶版:如何精确有效完成实验

【字体: 时间:2015年03月03日 来源:生物通

编辑推荐:

  我们需要更加精确和有效的CRISPR工具,研究人员也正在研究如何避免错误情况的发生,开发更好的预测编辑工具,或者研发能将CRISPR元件更有效传递到细胞内的方式。

  生物通报道:生物学家们总是沉迷于对基因组修修补补,而其中一种近期红得发紫的技术就是 CRISPR。自2012年CRISPR/Cas 首次作为一种基因组编辑工具登台以来,关于这种技术的论文数量就大幅增加,最好的证明之一就是2015年两位科学家由于在CRISPR基因组编辑技术方面的重要贡献而获得“科学突破奖”,其中一位获奖者:Jennifer Doudna 最近在范德堡大学进行客座演讲,主会场和分会场都挤满了人,从中可以窥见这一技术的火热程度。

CRISPR全称为clustered regularly interspersed short palindromic repeats,是源于细菌及古细菌中的一种后天免疫系统,它可利用靶位点特异性的RNA指导Cas蛋白对靶位点序列进行修饰。直到近年,科学家们才开始利用这一系统在活体动物基因组中生成靶向突变,删除原有的基因或插入新基因。

这一技术发展迅速,就在去年,研究人员已经发现了利用CRISPR/Cas 治愈小鼠中一种罕见肝脏疾病的方法,并且科学家们也发现可以通过这种方法切除人类免疫细胞中HIV病毒插入的基因,阻止HIV进入血液干细胞。其原因可能在于这种方法比其它基于核酸酶的编辑方法操作简便,研究人员跟着指南操作,进行一轮PCR就能基本完成CRISPR实验了。

延伸阅读:明星技术CRISPR新手操作指南

但CRISPR/Cas系统也存在自身的一些缺陷,比如进入细胞后,有可能在非目标位点进行酶切,从而导致脱靶,这对于临床应用来说是一大败笔。

我们需要更加精确和有效的CRISPR工具,研究人员也正在研究如何避免这类情况的发生,开发更好的预测编辑工具,或者研发能将CRISPR元件更有效传递到细胞内的方式,以下是The Scientist杂志汇总的新进展。

癌症研究的启示

研究者:康奈尔大学遗传学教授John Schimenti

项目:利用 CRISPR/Cas9 研发癌症和减数分裂小鼠模型

CRISPR/Cas9系统是通过在基因组上造成切口来完成编辑工作,这些切口可以通过两种途径修复,一种是由非同源性末端接合(Non-homologous end joining, NHEJ) 过程进行粘合,这种方法有效但容易出错;另外一种方法就是加入包含精确目标突变的DNA人工片段,利用同源指导修复(homology-directed repair,HDR,生物通译)完成。

Schimenti 说,“问题在于这两个过程是竞争完成的。前者NHEJ会由于实验小鼠出现非目标突变受到干扰,”他们希望能找到一种HDR途径新方法完成有效,且更精确的编辑,

为了解决这一问题,研究人员尝试针对过去的果蝇胚胎基因组编辑实验改进 HDR/NHEJ 比例,他们通过遗传手段抑制了NHEJ途径中的一个分子:DNA连接酶IV,碰巧正好有这么一个小分子抑制剂,SCR7能抑制这种酶的作用(这种小分子在之后的实验中被证明能作为癌症治疗分子)。

Schimenti研究组在小鼠胚胎中改变了一个基因的两个碱基,结果证明加入SCR7能将HDR:NHEJ比率从之前的1:10调整为1:2.5,这一研究成果公布在今年的Genetics杂志上,标题为A Mouse Geneticist’s Practical Guide to CRISPR Applications。

如何操作:

只要在Cas9 和合成的DNA 被注入到你的单细胞受精卵之后,在培养基中添加 SCR7就可以了。一些其他的研究组,如范德堡大学的Douglas Mortlock也在尝试进行这一实验。Schimenti实验室常会在实验中加入这种物质,因为目前看来SCR7并不会造成什么伤害,不过“这种小分子确实会影响其它基因,所以还是需要进行对比实验,”他说。

注意事项:

培养基中加入了SCR7(50 μ M)的受精卵生存率更高,但是在two-cell阶段,SCR7 会影响细胞进入囊胚期,其原因尚不清楚。但Schimenti表示这应该不成问题,因为在那之前就可以将其转入到雌性小鼠中了。

成本:从Xcessbio公司可以买到SCR7,价格为129 美元/2 mg(当地价格)。

相关新闻
生物通微信公众号
微信
新浪微博
  • 搜索
  • 国际
  • 国内
  • 人物
  • 产业
  • 热点
  • 科普
  • 急聘职位
  • 高薪职位

知名企业招聘

热点排行

    今日动态 | 生物通商城 | 人才市场 | 核心刊物 | 特价专栏 | 仪器云展台 | 免费试用 | 今日视角 | 新技术专栏 | 技术讲座 | 技术期刊 | 会展中心 | 中国科学人 | 正牌代理商

    版权所有 生物通

    Copyright© eBiotrade.com, All Rights Reserved

    联系信箱:

    粤ICP备09063491号