CRISPR操作指南进阶版(三)

【字体: 时间:2015年03月03日 来源:生物通

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  对于导向RNA来说,比如20个碱基的长度就能很好的与其基因组中靶向序列进行匹配,但是这种长度也能与错配碱基结合,造成脱靶效应。

  

生物通报道:CRISPR全称为clustered regularly interspersed short palindromic repeats,是源于细菌及古细菌中的一种后天免疫系统,它可利用靶位点特异性的RNA指导Cas蛋白对靶位点序列进行修饰。

这一技术发展迅速,就在去年,研究人员已经发现了利用CRISPR/Cas 治愈小鼠中一种罕见肝脏疾病的方法,并且科学家们也发现可以通过这种方法切除人类免疫细胞中HIV病毒插入的基因,阻止HIV进入血液干细胞。其原因可能在于这种方法比其它基于核酸酶的编辑方法操作简便,研究人员跟着指南操作,进行一轮PCR就能基本完成CRISPR实验了。

但CRISPR/Cas系统也存在自身的一些缺陷,比如进入细胞后,有可能在非目标位点进行酶切,从而导致脱靶,这对于临床应用来说是一大败笔。

我们需要更加精确和有效的CRISPR工具,研究人员也正在研究如何避免这类情况的发生,开发更好的预测编辑工具,或者研发能将CRISPR元件更有效传递到细胞内的方式,以下是The Scientist杂志汇总的新进展。

第一篇:CRISPR操作指南进阶版:如何精确有效完成实验

第二篇:CRISPR操作指南进阶版(二)

如何消除脱靶效应

研究者:佐治亚理工学院生物医学工程教授Gang Bao

研究项目:基因靶向治疗单基因疾病

对于导向RNA来说,比如20个碱基的长度就能很好的与其基因组中靶向序列进行匹配,但是这种长度也能与错配碱基结合,造成脱靶效应。

近期大量基于网站的分析工具都可以用于寻找脱靶序列,但是目前的运算法则会遗漏两种出现在导向RNA和结合DNA之间长度差异以外的非特异性结合。举例来说,即使RNA导向配对序列要比靶向DNA长一到两个碱基,这两者依然能配对结合,但是会产生一个“RNA凸起(RNA bulge,生物通译)”。相反,如果DNA序列比导向RNA序列稍微长一点,就会产生一个“DNA凸起”。

事实上,去年Bao研究组就发现凸起变量的脱靶结合会导致非目标基因组编辑(CRISPR/Cas9 systems have off-target activity with insertions or deletions between target DNA and guide RNA sequences)。“对于所有这些研究,我们都十分担心特异性的问题,”Bao说。

为了能找到潜在可能的脱靶效应,Bao研究组研发了一种称为COSMID的工具,这种工具配合其它CRISPR工具可以帮助研究人员设计出一种最小化非特异性Cas9剪切的RNA。如果研究人员已经构建了导向RNA,那么这种工具还可以帮助他们发现基因组中潜在的脱靶位点。

如何操作:

在COSMID网站 (crispr.bme.gatech.edu) 上,研究人员可以从列表中挑选目标基因组,然后输入你的导向序列,以及筛选最佳设计的相关参数。或者也可以利用引物设计框来严重潜在的脱靶位点。

注意事项:

COSMID与其他 CRISPR 设计工具一样, 不仅会识别出潜在的脱靶位点,也会根据其相关度进行排序。“这种排序本身并不是那么精确,”Bao说,由于许多其它的因素也会影响概率分布,因此脱靶序列预测需要通过实验进行验证。

同时范德堡大学的Mortlock也表示还可以利用这一工具预测特异性项目的范围,比如说,如果你想要从一种细胞系中除去一种蛋白产物,那么就可能无法太关注另一个基因突变,反过来也是一样,如果实验目的是某种特殊表型相关的突变,那么就要检查一下脱靶的情况。

 

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