【新技能】“接力PCR”，仅一步完成靶标捕获和文库扩增

什么是接力PCR（RelayPCR™）？

请先浏览下图。上期【新技能】的主角（OmegaPrimer）会出现哟~

 
图1 RelayPCR™原理展示

Phase 1 Target Capture

在RelayPCR™体系中，预先加入反应所需的所有引物：特异性引物（specific primer）和通用引物（common primer）。Specific primer是不是很眼熟，没错，它就是上期介绍的omega primer。

1. 特异性的omega primer引物对与模板序列（template DNA）结合，进行2个Cycle的特异性扩增；要仔细查看上图中序列的颜色变化哦。

2. 2个Cycle扩增完毕后，omega primer的3p臂，5p臂，和环（loop）序列都已融入扩增子中，并完成了目标序列的捕获。

还记得这个loop吗？loop的序列可不是任意设计的，它与Phase 2 Library Amplification中使用的通用引物序列相同（见图中右下角）。2个Cycle结束时，通用引物的互补序列已纳入扩增子序列的两端。

Phase 2 Library Amplification

目标序列捕获阶段完成后，即自动进入文库扩增阶段。

1. 体系中的通用引物（common primer），与扩增产物上的互补序列结合，进行文库扩增。根据实验需要，可在通用引物的尾部（tail segment）设计指定的序列，如测序引物，barcode等。

2. 当所有的扩增循环结束后，目标序列的文库即制备完成。如为靶向测序文库，经纯化后，即可上机测序，无需进行额外的接头连接和扩增反应。

现在你知道什么是RelayPCR™了吗？

RelayPCR™：一次PCR反应即可同时完成目标序列捕获（Target Capture）与文库扩增（Library Amplification）。

是不是so easy，so happy呢！

小编知道你还有些地方没琢磨明白

Q：OmegaPrimer是如何设计和工作的？
A：你肯定错过了上期的OmegaPrimer介绍（点击阅读）。

Q：在Phase 1中，common primers不会干扰目标序列捕获吗？
A：不会。因为模板序列上没有common primers的互补序列。

Q：common primer和omega primer不会相互杂交吗？
A：不会。因为common primer与omega primer上的环序列是同向的，而非反向互补。

Q：为什么目标序列捕获完成后会自动接力到文库扩增过程？
A：因为体系中common primer的量远大于omega primer，因而在2个Cycle扩增完成后，扩增产物更易被common primer结合进行文库扩增。

RelayPCR™比传统多重PCR好在哪？

做多重PCR的艰辛，做过的人都明白，通常需要进行繁琐的条件优化，但结果仍难以令人满意。RelayPCR™彻底克服了传统多重PCR的制约。

RelayPCR™是一个优雅又简洁的一步式PCR反应，可以将一对通用引物，成千上万对特异性引物，和基因组DNA混合在一个样品管中。运行一次PCR即可无缝连接并完成两个功能独立的反应阶段，即靶标捕获和文库扩增。

Relay-PCR™技术的革命性创新在于，可以控制特异性引物（OmegaPrimer™）只在最初靶标捕获的两个循环中发挥作用，之后会自动切换到由通用引物引导的以相同效率进行的文库扩增，获得均一性非常高的文库（已有的实验数据表明，均一性超过97%）。这样的设计根本性地消除了传统多重PCR中由于成千上万对特异性引物的差异扩增给文库制备造成的负面影响。

如果把RelayPCR™ 和OmegaPrimer™组合在一起，会带来怎样的惊喜呢？

留在下周告诉各位吧。

对于RelayPCR™或OmegaPrimer™，你还有其它想了解的吗？

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