技术指南:从组织样品中提取核酸(一)[选购宝典]

【字体: 时间:2015年07月14日 来源:生物通

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  组织,是介于细胞和器官之间的中间体,也是生命科学研究的经典材料。无论是克隆、定量PCR,还是测序,从组织样品中提取核酸都是绕不过去的一步。试剂盒当然是个好选择,因为它们既方便,又省时。通常来说,试剂盒中包含了组织匀浆和细胞裂解的缓冲液,以及从裂解液中提取和收集DNA或RNA的工具。

组织,是介于细胞和器官之间的中间体,也是生命科学研究的经典材料。无论是克隆、定量PCR,还是测序,从组织样品中提取核酸都是绕不过去的一步。试剂盒当然是个好选择,因为它们既方便,又省时。通常来说,试剂盒中包含了组织匀浆和细胞裂解的缓冲液,以及从裂解液中提取和收集DNA或RNA的工具。

不过,市场上有这么多选择,怎么知道应该选哪一个呢?翻开目录,打开网站,一个一个地去找,这显然不现实。这么痛苦的工作,还是交给生物通吧。其实,试剂盒选择的关键因素就在于组织的类型或状态。组织可能是新鲜的、冻存的,也可能是福尔马林固定、石蜡包埋的,也就是FFPE组织。当然,某些组织类型可能难度更大。

写在前面的话

组织,虽然只是简单一个词,却代表着千差万别的样品。同样大小的组织样品,在细胞数量上可能差别很大,这要取决于年限、器官以及来源的物种。试剂盒的说明书中通常都有建议用量。需要注意的是,肝脏和脾脏是转录非常活跃的器官。对于来源于这些器官的组织样品,其蛋白质和RNA含量都很高。因此,在制备基因组DNA时,只使用标准用量的75-85%就够了。

此外,骨骼肌中的收缩蛋白、心脏中的结缔组织,以及皮肤中的胶原,都让核酸提取的难度升级。植物样品往往也很棘手。有些代谢物的化学性质与核酸类似,这使得它们难以去除。凑热闹的代谢物(如多糖、多酚和黄酮)以及纯化过程中引入的污染物(如盐或酚)会抑制酶促反应,或干扰凝胶迁移。FFPE组织样品更不必说,信息量大,挑战更大。不过,如今各大厂家都针对这些困难样品,开发出了各种各样的应对方案。

样品裂解

裂解组织样品是释放核酸的第一步。你所使用的方法取决于你的组织类型,因为有一些更难匀浆和裂解,让提取变得十分困难。许多组织通常在水性的裂解试剂中匀浆,其中包括Tris和EDTA等缓冲液,以及SDS或Triton X-100等去污剂。RNA提取的裂解试剂可能还包括RNase抑制剂。

这些是标准的做法。对于那些坚硬、耐磨和难以处理的样品,之前还需要增加一步组织破碎。MP Bio的FastPrep-24™ 5G样品制备系统就能胜任这样的工作。它通过剧烈搅拌管内的裂解介质(如硅珠、玻璃珠或陶瓷珠)和样品,来破坏微生物、动物或植物的组织。作为MP Bio的第五代产品,它首次使用触摸屏界面,操作更为简便直观;同时动力增强,处理样品更加快速。针对不同的样品,MP Bio有16种裂解介质可供你灵活选择。【延伸阅读:样品制备,有这台仪器就够了

对于骨骼肌、心脏和皮肤这些挑战性的样品,最常见的做法是添加高浓度的离液盐,如异硫氰酸胍或尿素,或者加入蛋白酶和蛋白酶K来选择性分解蛋白。植物的话,通常都有专门的试剂盒,比如QIAGEN的DNeasy Plant Mini/Maxi Kit。试剂盒中的缓冲液条件经过设计,可实现DNA与硅胶膜的特异结合,同时去除多糖、多酚及其他代谢产物。

了解QIAGEN适合各种组织样品的试剂盒


DNA纯化

裂解之后,粗制的DNA产物必须经过纯化,以去除裂解过程中使用的去污剂、蛋白质、盐和试剂。大多数试剂盒都利用了硅胶与DNA或RNA结合的能力。试剂盒中要么使用硅胶膜离心柱,要么使用硅包被的磁珠。对于前者,硅包被的膜嵌在离心柱中。裂解液穿过硅胶膜时,核酸与膜结合。之后添加水或缓冲液可释放核酸。对于后者,包被硅的磁珠收集核酸,之后利用磁性可将其分离。

离心柱方便易用,是低通量实验室的首选。各个厂家也都提供此类产品。对于那些一次处理大量样品的实验室,基于磁珠的提取试剂盒则是更理想的选择。硅包被的磁珠与裂解液混合,释放到溶液中的核酸与磁珠结合,之后通过磁性将复合物从裂解液中拉出。添加水或缓冲液,可从磁珠上释放核酸。此过程非常快速,需要付出的劳动很少,因为磁铁已经做了大部分的工作。

对于那些对纯度要求高的实验,阴离子交换方法则是更好的选择。它所产生的DNA在纯度上至少相当于两轮的CsCl密度梯度纯化,同时片段长度也远远优于硅胶膜技术。QIAGEN Genomic-tips使用独特的阴离子交换技术,从多种生物样品中纯化高分子量的DNA,无需酚氯仿。在缓冲液所提供的pH和低盐环境下,DNA与树脂结合,而其他细胞成分则流出。纯化后的DNA洗脱在高盐溶液中,并通过异丙醇沉淀。Genomic-tips通过重力流操作,且能够带来长达50-100 kb的DNA片段。

 

阴离子交换

硅胶膜技术

磁珠技术

技术

固相的阴离子交换层析

选择性吸附到硅胶膜上

在可控的离子条件下与磁珠颗粒结合

结合/洗脱

结合:可变的盐浓度和pH

洗脱:可变的盐浓度和pH

需要乙醇或异丙醇沉淀

结合:高盐

洗脱:低盐

即用的洗脱液

结合:高盐

洗脱:低盐

即用的洗脱液

应用

带来超纯的核酸,为敏感的应用带来最佳的结果

带来高纯度的核酸,适合大多数下游应用

带来高纯度的核酸,适合大多数下游应用

优点

纯度高,片段长

快速、便宜

易于自动化

一些试剂盒不使用硅胶,而是依靠化学试剂。这当中,最出名的要属Life Technologies的DNAzol试剂。组织在DNAzol中匀浆和裂解,再通过离心沉淀和去除细胞碎片。之后加入乙醇,沉淀DNA。整个过程可在10-30分钟内完成,DNA回收率在70-100%。

RNA纯化

DNA纯化的方法并不能直接应用在RNA上,因为RNA在结构上与DNA完全不同。RNA是单链的,而DNA以双链居多。分离出完整的RNA也绝非易事,因为RNase无处不在。因此,RNA纯化需要特别小心,只能使用RNase-free的溶液和耗材。

对于组织样品的RNA纯化,引用最多的产品无疑是Life Technologies的TRIzol® 试剂。这种酚和异硫氰酸胍单相溶液可从人、动物、植物等多种来源的组织样品中提取出高质量的总RNA,在1小时内即可完成。如果你需要更高质量的RNA,可以尝试一下TRIzol Plus RNA Purification Kit。这个试剂盒融合了TRIzol试剂强大的裂解能力,以及方便的硅胶膜操作,带来超纯的总RNA,也适合纤维或脂肪组织。

至于前文提到的一些困难组织,Ambion也提供了一些RNA纯化的操作建议。

• 对于心脏和骨骼肌等纤维组织,最大的挑战在于制备组织匀浆液时完全破碎所有细胞。由于细胞密度低,这些组织的核酸产量往往比较低;因此,最大限度地利用组织是非常关键的。在干冰或液氮下进行匀浆,将组织磨成粉末同时让组织保持冷冻对分离完整的RNA很重要。
• 大脑和植物组织富含脂肪,这使得RNA提取复杂化,无法清晰分离RNA。在使用酚:氯仿:异戊醇提取时,白色絮状物质将占了水相的大部分。这种白色物质可能含有脂类,不能形成清晰的边界。在这种情况下,可加入1/10体积的氯仿:异戊醇,混合均匀,并再次离心。
• 大鼠的脾脏和胸腺富含核酸酶和核酸。高效匀浆对减少核酸的影响很重要。在液氮下将脾脏和胸腺切成小块,能实现快速匀浆。不过,高的DNA和RNA含量会使得匀浆液很粘稠,导致不完全分相。这时,添加更多的裂解液或用酚:氯仿:异戊醇重新提取,有望缓解这一问题。
• 对于任一种组织,采集样品后阻止RNase的活性都是当务之急。快速冷冻固然是一种方法,但Ambion建议使用RNAlater稳定剂。这种试剂能立即渗透到组织中,让RNase失活。在某些不方便使用液氮的情况下,这的确是好选择。

此外,多个厂家也提供为RNA提取而优化的离心柱试剂盒,包括罗氏的High Pure RNA Tissue Kit、Bio-Rad的Aurum™ Total RNA Mini Kit等。如果你需要同时提取DNA和RNA,可以看看QIAGEN的AllPrep DNA/RNA Mini Kit。

自动化提取

众所周知,核酸提取的主要挑战在于重复性,而全自动的核酸纯化仪保证了样品之间和运行之间的一致性。罗氏提供了一系列MagNA Pure全自动核酸纯化仪,满足了从低通量到高通量实验室的需求。

MagNA Pure LC 2.0可以从各种不同类型的样品(包括组织和石蜡包埋组织切片)中分离纯化DNA、RNA或总核酸(DNA和RNA)。仪器基于罗氏经典的磁珠技术,通过机械臂的作用,在吸液枪头中完成所有的分离纯化步骤,完全摆脱常规核酸提取中必需的离心、过滤等操作,而且无需真空泵和真空管,尽可能地避免了交叉污染的风险。仪器支持样品体积为20 –1000 μl,洗脱体积为 50–200 μl,移液体积为5 –1000 μl。

如今,有了高纯度的DNA和RNA,后面那些克隆和分析操作自然就不在话下了。下一篇,我们再来介绍如何对付难搞的FFPE样品。(生物通 余亮)

延伸阅读:

技术指南:从组织样品中提取核酸(二)

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