如何利用CRISPR来开展全基因组筛选[创新技巧]

许多科学家在研究一些遗传原因还不完全清楚的疾病。那么，哪些基因对你的表型很重要？这可能需要大量的实验，来研究各个基因或整个通路在特定疾病中的作用，并协助新疗法的开发。尽管CRISPR/Cas9并非开展正向遗传学筛选实验的首个方法，但无疑是最强大的。在此，Addgene的资深科学家Joel R. McDade将教你如何利用CRISPR文库来开展全基因组的筛选。

与之前的基因组编辑技术相比，CRISPR/Cas9的主要优势在于它的简单和通用。CRISPR/Cas9系统有两部分组成：非特异性的核酸内切酶（Cas9）和单链的向导RNA（gRNA）。gRNA上~20个核苷酸的“靶向”序列是由用户定义的，可以很容易地修改，让Cas9靶定几乎任何基因组位点，只要它是独特的。

将野生型的Cas9和gRNA共同导入细胞，会在目标DNA上产生双链断裂，随后，通过容易出错的非同源末端连接（NHEJ）来修复，在靶基因中产生功能丧失的突变。利用去核酸酶活性的Cas9（dCas9）以及dCas9激活剂/抑制剂，能够激活或抑制靶基因，而不永久性修饰基因组。

CRISPR文库的构建与选择

全基因组筛选实验的目标是产生并筛选突变细胞的群体，以鉴定出与特定表型相关的基因。CRISPR/Cas9可轻松放大到全基因组筛选，因为广泛的靶序列存在，而产生含gRNA的质粒也不难。CRISPR/Cas9全基因组筛选实验通常是利用慢病毒，向表达Cas9的细胞中导入gRNA文库。

这个慢病毒CRISPR文库由多个含gRNA的慢病毒转移载体组成，每个靶定基因组中的特定基因。每个gRNA是利用公开的gRNA设计软件在电脑上设计并合成的。之后将合并的gRNA克隆到慢病毒转移载体中，产生最终的CRISPR文库。将gRNA文库与各种Cas9组合在一起，可实现靶基因的敲除、激活或抑制。目前，Addgene提供一些CRISPR文库。

那么，如何选择CRISPR文库？在此，你需要考虑这几个因素。1) 你的细胞来源于哪个物种？目前，Addgene提供靶定人类或小鼠基因的CRISPR文库。2) 你希望进行哪种遗传修饰？Addgene的CRISPR文库可用于基因敲除（小鼠和人类）、激活（小鼠和人类）和抑制（小鼠）。3) 你试图靶定基因组中的每个基因，还是一类特定的基因？现在有一些全基因组的CRISPR文库以及靶定某一类基因的文库供你选择。在实验设计时，你需要周密考虑，以便选择适当的CRISPR文库。

如何进行CRISPR筛选？

利用CRISPR文库来开展正向遗传学筛选包括多个步骤。在大多数情况下，CRISPR文库是以极低的浓度提供的。因此，第一步就是将你的文库扩增到一定程度，足以产生慢病毒。记住，你需要使用新一代测序来检查文库的代表性，也就是扩增前后每个gRNA的比例。随后，用含有CRISPR文库的慢病毒转导细胞，产生突变细胞的异质群体，其中每个细胞或每组细胞含有不同基因的突变。

接着，利用药物选择或基于荧光的细胞分选来富集突变细胞，并筛选特定表型。例如，突变细胞可用在药物筛选中，以鉴定赋予耐药性的基因。具体来说，我们可利用某种药物来处理突变的细胞，并分析耐药性群体与对照相比的gRNA分布。在这种情况下，与突变时赋予耐药性的基因相对应的gRNA可富集起来。根据这一类型实验的结果，可了解细胞耐受药物的机理，有助于确定未来的治疗目标。

整个实验过程看上去并不难，但也有一些需要注意的地方。

新一代测序 – CRISPR文库中包含数千个gRNA质粒，每个质粒都带有一个独特的条形码，以便识别。因此，在扩增后和筛选后对CRISPR文库进行测序，需要使用到新一代测序。

代表性 – 在大多数文库中，每个靶基因都有3个或以上的gRNA，维持每个gRNA在群体中的分布，也就是代表性，这是相当重要的。由于特定gRNA的富集或去除而导致代表性损失，会带来不准确的结果。

选择细胞类型 – 从理论上说，任何细胞类型都能用于CRISPR筛选。不过，为了让你的突变群体有足够的代表性，就需要大量的细胞作为起始材料。因此，低丰度的细胞并不是很适合全基因组筛选。

避免假阳性和假阴性 – 与任何实验一样，使用适当的对照、多次重复和几种细胞类型，可加强你的结果。此外，针对同一基因的多个gRNA的富集或去除也是有力的证据，说明特定基因对某个表型很重要。筛选的每个“hit”都应当独立验证，以确保这个修饰产生了你想要的表型。

有了合理的实验设计和适当的验证操作，CRISPR文库就能帮助你深入了解感兴趣的表型。（生物通 余亮）

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