Nature Biotechnology揭示Cas9改造极限

　　

生物通报道：生物学家们一直在打磨能够进行DNA编辑的工具，而CRISPR技术很快成为了其中最耀眼的明星。CRISPR体系包括一个细菌核酸酶（Cas）和一段与目标DNA匹配的引导RNA，能为细菌沉默入侵者（比如病毒）遗传信息的关键部分。与其他基因编辑技术相比，CRISPR技术更易于操作扩展性也更强，因此迅速成为了科研领域的宠儿，为基因工程和生物医学领域带来了一场革命。

酿脓链球菌的Cas9现在已经被广泛用于基因组编辑。那么，对Cas9进行基因工程改造将面临哪些限制呢？加州大学伯克利分校的研究团队通过随机插入突变对Cas9结构进行了全面分析，鉴定了这种蛋白的基因改造热点。这些位点可以耐受PDZ结构域的插入，不影响Cas9的结合和剪切功能。这一重要成果发表在五月二日的Nature Biotechnology杂志上，文章通讯作者是加州大学伯克利分校的David F Savage，著名CRISPR先驱Jennifer A Doudna也参与了这项研究。

研究人员在自己鉴定的改造热点上插入雌激素受体α配体结合结构域，由此构建了别构调节的Cas9。研究显示，别构调节的Cas9在原核和真核细胞中表现出配体依赖的激活。这是一种能够诱导可逆Cas9活化的通用型单组分体系。这项研究为Cas9基因工程改造提供了宝贵信息，可以帮助人们快速生成新型Cas9用于基因组编辑。

加州大学伯克利分校以Jennifer A Doudna为首的研究团队取得了诸多令人侧目的CRISPR研究成果。去年十月，Doudna及其同事在Nature杂志上发表文章指出，Cas9 的HNH核酸酶结构域构象状态直接控制了DNA切割活性。他们通过分子内荧光共振能量转移（FRET）实验，鉴定了HNH核酸酶结构域的一种激活构象。研究还证实，一个α-螺旋将HNH的构象改变传达给RuvC结构域，激活它实现DNA切割。（更多详细信息请参见：Nature：揭示CRISPR/Cas9的DNA靶向切割机制）

今年年初，Doudna团队揭示了CRISPR-Cas9准备剪切DNA时的关键分子结构。在CRISPR-Cas系统中，Cas蛋白与小CRISPR RNA（crRNA）形成复合体，切割与RNA互补的外源DNA。R-loop是I型和 II型CRISPR-Cas的一个典型特征，基因组编辑常用的sgRNA就会和Cas9形成R-loop。为了阐明R-loop的作用，研究人员通过冷冻电镜获得了酿脓链球菌Cas9 R-loop的高分辨率结构。（更多详细信息请参见：CRISPR先驱Science再发重量级成果）

自CRIPSR系统被开发成研究工具以来，这一技术就陷入了激烈的知识产权之争。以Doudna为首的加州大学团队是CRIPSR专利的有力竞争者。前不久CRIPSR领域迎来了的一个重磅新闻，美国专利和商标局（USPTO）二月十六日将一项基因编辑专利授予了Doudna的Caribou Biosciences公司。这再次搅浑了原本已经相当复杂的CRISPR知识产权形势。（更多信息请参见：战况激烈，张锋对手获CRISPR新专利）

生物通编辑：叶予

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