Nature Biotechnology聚焦新一代CRISPR系统Cpf1

【字体: 时间:2016年06月29日 来源:生物通

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  来自麻省总医院、哈佛医学院的研究人员,解析了新一代的CRISPR-Cas Cpf1核酸酶在人类细胞中的全基因组特异性。研究结果发布在6月27日的《自然生物技术》(Nature Biotechnology)杂志上。

  

生物通报道  来自麻省总医院、哈佛医学院的研究人员,解析了新一代的CRISPR-Cas Cpf1核酸酶在人类细胞中的全基因组特异性。研究结果发布在6月27日的《自然生物技术》(Nature Biotechnology)杂志上。

麻省总医院病理学系研究员及研究副主任J. Keith Joung博士及研究员Benjamin P Kleinstiver博士是这篇论文的共同通讯作者。近年,Joung在CRISPR研究中取得了大量重要的研究成果。

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2014年,Joung领导麻省总医院的研究人员开发了新一代的基因组编辑系统,可大大降低生成不必要的、脱靶基因突变的风险。在发表于Nature Biotechnology杂志上的一篇论文中,作者们报告称,一种新型的基于CRISPR的RNA引导性核酸酶技术通过利用两条引导RNAs,大大降低了在错误的位点切割DNA链的机会(Nature子刊:新技术显著提高CRISPR系统精确性 )。

同年12月,Joung研究团队还开发出了在基因组范围内检测CRISPR脱靶效应的全新方法,。这一成果发表在Nature Biotechnology杂志上(Nature Biotechnology:CRISPR脱靶的全基因组图谱 )。

2015年6月,Joung研究小组找到了一种新方法来扩大强大基因编辑工具——CRISPR-Cas9 RNA引导核酸酶的使用及提高其精确性。他们的研究论文发表在Nature杂志上(Nature发布CRISPR-Cas9重大新成果 )。

在2016年Nature杂志上的一篇研究论文中,Joung描述了改造Cas9酶,减少它与靶DNA的非特异性互作,大大扩展这一基因编辑技术应用的过程。这种改良版本的新型基因编辑CRISPR-Cas9核酸酶似乎可以强有力地消除当前这一技术一个非常重要的限制:不必要的脱靶DNA断裂,将它们降低至无法检测到的水平(Nature发布突破性CRISPR-Cas9新技术 )。

CRISPR系统编码的RNA引导核酸内切酶对于细菌适应性免疫至关重要。CRISPR-associated (Cas)核酸酶可以很容易被重编程来切割靶DNA序列,在各种生物体中实现基因组编辑。其中的一类核酸酶Cas9蛋白与两种短RNAs:crRNA和tracrRNA形成复合物。最常用的Cas9直系同源物SpCas9利用了在5′末端包含20个核苷酸(nt)与靶DNA位点“前间隔序列”( protospacer)区域互补的crRNA。crRNA和tracrRNA通常结合成大约100-nt的单导向RNA (gRNA),指导SpCas9的DNA切割活性。有效地切割还要求SpCas9识别前间区序列邻近基序(protospacer adjacent motif,PAM)。当前,研究人员已采用许多不同的方法确定了SpCas9核酸酶与不同gRNAs配对的全基因组特异性。并构建出了一些全基因组特异性显著增高的SpCas9变体。

近期,科学家们发现了一种叫做Cpf1的Cas蛋白,证实也可以重编程它来切割靶DNA序列。不同于SpCas9,Cpf1只需要一个42-nt的crRNA,这一crRNA在它的3′端有23 nt与靶DNA序列的前间隔序列互补。此外,SpCas9识别的是前间隔序列3′端的NGG PAM序列,而AsCpf1和LbCpf1识别的是前间隔序列5′端的TTTN PAMs。早期的一些实验表明,可以重编程AsCpf1和LbCpf1核酸酶来编辑人类细胞中的靶位点,但只在少量位点对它们进行了测试,且尚未确定它们的全基因组特异性。

在这篇文章中研究人员证实两种Cpf1核酸酶AsCpf1和LbCpf1在人类细胞中的打靶效率与广泛使用的SpCas9相当。他们还证实利用来编程Cpf1核酸酶的crRNA 3′端有4-6个碱基对单碱基错配不敏感,而crRNA这一区域的许多其他碱基则对单碱基或双碱基替换高度敏感。针对两种Cpf1核酸酶采用GUIDE-seq测序方法和靶向深度测序分析,他们证实与20种不同的crRNAs配对一半以上的无法检测到脱靶切割。

这些研究结果表明AsCpf1和LbCpf1在人类细胞中具有高度的特异性。

(生物通:何嫱)

生物通推荐原文摘要:

Genome-wide specificities of CRISPR-Cas Cpf1 nucleases in human cells

The activities and genome-wide specificities of CRISPR-Cas Cpf1 nucleases1 are not well defined. We show that two Cpf1 nucleases from Acidaminococcus sp. BV3L6 and Lachnospiraceae bacterium ND2006 (AsCpf1 and LbCpf1, respectively) have on-target efficiencies in human cells comparable with those of the widely used Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9)2, 3, 4, 5. We also report that four to six bases at the 3′ end of the short CRISPR RNA (crRNA) used to program Cpf1 nucleases are insensitive to single base mismatches, but that many of the other bases in this region of the crRNA are highly sensitive to single or double substitutions. Using GUIDE-seq and targeted deep sequencing analyses performed with both Cpf1 nucleases, we were unable to detect off-target cleavage for more than half of 20 different crRNAs. Our results suggest that AsCpf1 and LbCpf1 are highly specific in human cells.

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