张锋参与发表CRISPR新研究成果

2016年7月29日，国际学术期刊《Journal of Biological Chemistry》在线发表了哈佛大学医学院、麻省理工学院-哈佛大学Broad研究所和山西眼科医院等处的一项最新研究成果，哈佛大学医学院眼科系Schepens眼科研究所的Hetian Lei博士是本文通讯作者，CRISPR/Cas9技术的先驱开创者之一、Broad研究所的张锋（Feng Zhang）博士以及山西省眼科医院的段雅剑（Yajian Duan）博士也是本文共同作者。

　　

生物通报道：2016年7月29日，国际学术期刊《Journal of Biological Chemistry》在线发表了哈佛大学医学院、麻省理工学院-哈佛大学Broad研究所和山西眼科医院等处的一项最新研究成果，题为“The Clustered, Regularly Interspaced, Short Palindromic Repeats-associated Endonuclease 9 (CRISPR/Cas9)-created MDM2 T309G Mutation Enhances Vitreous-induced Expression of MDM2 and Proliferation and Survival of Cells”，哈佛大学医学院眼科系Schepens眼科研究所的Hetian Lei博士是本文通讯作者，CRISPR/Cas9技术的先驱开创者之一、Broad研究所的张锋（Feng Zhang）博士以及山西省眼科医院的段雅剑（Yajian Duan）博士也是本文共同作者。延伸阅读：张锋畅谈其CRISPR/Cas9前沿性研究工作；聚焦最新CRISPR专利，张锋独占6项；2016年加拿大“小诺贝尔奖”公布 华人科学家张锋获奖。

增生性玻璃体视网膜病变（Proliferative  vitreoretinopathy，PVR）是一种威胁视力的疾病，是由孔源性视网膜脱离（RRD）以及开放性眼外伤的手术矫正引起的，其特征是形成视网膜前膜（ERMs）。ERMs是由细胞外基质蛋白和细胞（包括视网膜色素细胞、视黄醛细胞、纤维母细胞和巨噬细胞）组成。PVR发生在8%到10%接受RRD手术修复的患者当中，并占术后所有原发性故障的大约75%。

致癌基因蛋白MDM2是一个泛素蛋白连接酶，其人类同源物（也叫HDM2）是p53肿瘤抑制因子的一个重要的负调节因子；MDM2无效的胚胎小鼠致死表型，可以通过敲除p53基因而被阻止。实验兔的玻璃体优先激活血小板衍生生长因子受体α（PDGFRα）。这种激活转而会启动磷酸肌醇3激酶（PI3K）/ Akt下游的信号通路，从而提高p53的降解。用小分子Nutlin-3阻断MDM2 与p53结合，可在PVR家兔动物模型中保护家兔免于视网膜脱离。

有趣的是，在MDM2启动子位点中的单核苷酸多态性（SNPs）（rs2279744）的G等位基因，随后被发现与RRD患者较高的PVR风险相关。这个SNP还与致癌风险增加相关。MDM2第一内含子启动子位点上的SNP T309G（在第309个核苷酸的一个T到G的变化），可增强转录激活因子特异性蛋白（Sp）1的亲和力，从而导致MDM2的表达升高，以及随后p53在肿瘤细胞中的表达减弱。然而，这个SNP是否有助于PVR的发病机理，仍有待于探索。

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细菌和古细菌中的CRISPR和CRISPR相关核酸酶（Cas），提供了适应性免疫力对抗病毒和质粒，它们的CRISPR RNAs（crRNAs）被用来指导外来核酸的Cas裂解。在化脓性链球菌（Sp）中，Cas9（SpCas9）包含两个核酸酶结构域——RuvC和HNH，当被crRNA和tracrRNA引导时，每个能裂解双链靶DNA的一条链。这个SpCas9可以被重编程为使用处理后的sgRNAs（由crRNA和tracrRNA组成）靶定哺乳动物细胞中特定的基因组位点。

CRISPR/Cas9产生的特定基因组位点上的DNA双链断裂（DSBs），可以通过内源性修复机制——非同源末端连接（NHEJ）和同源性修复（HDR），而得以修复，这取决于细胞状态和一个修复模板的存在。NHEJ和HDR是细胞中两种截然不同的修复途径。NHEJ能够引入不可预知的插入和缺失（indel），它可以通过简单地再连接两个DSB末端，而修复病变；HDR可以使用一个外源性的单或双链DNA模板——具有预期的变化，在基因位点产生突变。然而，与NHEJ相比，HDR不常使用，因为它只发生在S和G2期，而NHEJ可以发生在整个细胞周期。最近，CRISPR/Cas9技术被用于真核细胞和小鼠的各种基因组编辑应用中，它提供了一个独特的机会来证明“MDM2 和T309G是否有助于PVR的发病机制”。

在这项研究中，研究人员利用CRISPR/Cas9技术，在人类原发性视网膜色素（hPRPE）细胞中的MDM2基因组位点产生了T309G突变。研究人员利用双腺相关的病毒衍生载体，将SpCas9和引导RNAs，连同一个同源修复模板，传递到靶向MDM2基因组位点，以在人类原发性视网膜色素上皮细胞（其基因型是MDM2 T309T）中产生MDM2 T309G突变。

新一代测序结果表明，利用腺相关病毒CRISPR/Cas9编辑过的hPRPE细胞中，有42.51%的MDM2 G309。这些数据表明，玻璃体可诱导MDM2的表达增加，以及随后p53在MDM2 T309G hPRPE细胞中的表达减弱。此外，这些实验结果表明，hPRPE细胞中的MDM2 T309G可增强玻璃体诱导的细胞增殖和存活，从而表明这一SNP有助于PVR的发病机制。

（生物通：王英）

生物通推荐原文摘要：
The Clustered, Regularly Interspaced, Short Palindromic Repeats-associated Endonuclease 9 (CRISPR/Cas9)-created MDM2 T309G Mutation Enhances Vitreous-induced Expression of MDM2 and Proliferation and Survival of Cells
Abstract: The G309 allele of SNPs in the mouse double minute (MDM2) promoter locus is associated with a higher risk of cancer and proliferative vitreoretinopathy (PVR), but whether SNP G309 contributes to the pathogenesis of PVR is to date unknown. The clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-associated endonuclease (Cas) 9 from Streptococcus pyogenes (SpCas9) can be harnessed to manipulate a single or multiple nucleotides in mammalian cells. Here we delivered SpCas9 and guide RNAs using dual adeno-associated virus-derived vectors to target the MDM2 genomic locus together with a homologous repair template for creating the mutation of MDM2 T309G in human primary retinal pigment epithelial (hPRPE) cells whose genotype is MDM2 T309T. The next-generation sequencing results indicated that there was 42.51% MDM2 G309 in the edited hPRPE cells using adeno-associated viral CRISPR/Cas9. Our data showed that vitreous induced an increase in MDM2 and subsequent attenuation of p53 expression in MDM2 T309G hPRPE cells. Furthermore, our experimental results demonstrated that MDM2 T309G in hPRPE cells enhanced vitreous-induced cell proliferation and survival, suggesting that this SNP contributes to the pathogenesis of PVR.